一种制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法及其应用。本发明专利技术包括如下步骤：(1)制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法；(2)体外合成sgRNA；(3)将sgRNA与Cas9蛋白显微注射到小菜蛾卵中；(4)培育靶点敲除小菜蛾，得到小菜蛾RDL亚基敲除品系。本发明专利技术还提供了小菜蛾RDL亚基敲除品系在研究小菜蛾抗性中的应用。本发明专利技术的方法突破了RNAi干扰技术的不可遗传，构建了可稳定遗传的敲除RDL亚基小菜蛾品系；通过氟虫腈对制备的小菜蛾RDL亚基敲除品系进行室内毒力测定试验，可以为小菜蛾抗性研究提供新方法，也可用于监测小菜蛾田间种群抗药性，指导田间合理用药。

A method for preparing RDL subunit knockout strains of Plutella xylostella and its application

【技术实现步骤摘要】
一种制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法及其应用。
技术介绍
小菜蛾(plutellaxylostellaL.)属鳞翅目菜蛾科，是一种重要的世界性经济作物害虫。小菜蛾对十字花科蔬菜的危害越来越严重，但其发生世代多,世代重叠严重,繁殖速度快,防治难度很大。目前为止，防治小菜蛾的主要手段依旧是采用化学药剂，但是随着化学杀虫剂的大量使用,小菜蛾产生了严重的抗性，防治难度加大。因此，小菜蛾抗药性研究、新农药研发以及制定合理的防治措施变得尤为重要。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)是脊椎动物及昆虫中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质，而γ-氨基丁酸受体(γ-aminobutyricacidreceptor,GABAR)是广泛分布于脊椎动物和昆虫中枢神经系统内的一种主要的抑制性受体。GABAR在结合其激动剂GABA后，使其门控的氯离子通道开放，氯离子流入细胞内部，使细胞膜超极化，从而抑制神经元的兴奋(Olsen,2015)。GABAR是多种杀虫剂的重要作用靶标，氟虫腈是典型的作用于GABA受体的一种苯基吡唑类杀虫剂，通过与昆虫GABAR结合，阻断氯离子通道，导致昆虫神经和肌肉过度兴奋而死亡(Schofieldetal.,1987；Anzeliusetal.,1995；Mehtaetal.,1999；Ikeda,etal.,2004)。GABAR在昆虫的中枢神经系统和周缘神经系统中均发挥着重要的生理作用。迄今为止，来自黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的3个昆虫GABAR亚基已被鉴定并成功克隆，分别是RDL(resistancetodieldrin)亚基(Ffrench-Constantetal..1991)、LCCH3(ligandgatedchloridechannelhomologue3)配体门控氯离子通道同系物3(Hendersonetal..1993)和GRD(GABAandglycine-likereceptorofDrosoplila)果蝇的类似GABA和甘氨酸受体(Harveyetal..1994)。其中，RDL亚基因其对环戊二烯类杀虫剂狄氏剂(dieldrin)产生抗性突变而得名。研究表明，在体外异源表达时，只有RDL亚基能形成功能性的GABA门控氯离子通道(Wangetal..2016)，具有与哺乳动物GABAR相似的功能，因此昆虫GABAR也叫RDL受体。当前国内外针对GABA的研究主要集中在RDL亚基。在小菜蛾中，RDL受体有RDL1亚基和RDL2亚基两种分型。据报道，两个亚基可能存在基因冗余的作用，但其两者具体作用并不明确(Guestetal..2019)。随着分子生物学的发展,通过RNA干扰(RNAi)特异沉默基因表达，比较基因沉默前后生物的变化,可以阐明基因的功能。RNAi技术具有快速、高效、特异性强、操作简易等优点,在后基因组时代中发挥重要作用，但其存在位置效应、临时性和不完全敲除的缺点(Yinetal..2006)，并且RANi干扰并不能完全抑制基因的表达，有一定的时效性，存在瞬时性的弊端，且不能遗传给后代(孙玉章等，2016)，无法对种群进行遗传上的研究。目前，还没有稳定的小菜蛾RDL亚基敲除品系的制备方法见报道，也没有利用RDL亚基对小菜蛾抗性进行研究的报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法。本专利技术的另一目的在于提供上述方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法，包括如下步骤：(1)利用CRISPR/Cas9系统选择RDL基因敲除靶点；(2)体外合成sgRNA：设计sgRNA模板的扩增引物，扩增，得到sgRNA模板片段，体外转录，纯化，得到sgRNA；(3)显微注射：将步骤(2)体外合成的sgRNA与Cas9蛋白混合，孵育，显微注射到小菜蛾卵中；(4)培育靶点敲除小菜蛾：将步骤(3)显微注射后的小菜蛾卵孵化，得到的G0代和同代G0代自交或者和野生型杂交，得到突变体G1代，之后对G1代连续多代自交，得到纯合突变体，即小菜蛾RDL亚基敲除品系。步骤(1)中所述的RDL基因敲除靶点包括：核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的RDL1基因敲除靶点；核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的RDL2基因敲除靶点。所述的sgRNA模板的扩增引物从5’端到3’端包括以下可操作性元件(图2)：额外序列、T7启动序列、G(s)碱基、RDL基因敲除靶点序列以及sgRNA质粒模板序列。所述的sgRNA模板的扩增引物序列PxRDL1-gRNAF和PxRDL2-gRNAF如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。步骤(3)中所述的sgRNA的用量为按其与所述的Cas9蛋白以质量比1：2混合。步骤(3)中所述的孵育优选为37℃孵育15min。上述制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法在研究小菜蛾抗性中的应用。所述的应用包括以下步骤：将上述方法制备而得的RDL敲除的小菜蛾品系使用苯基吡唑类药物进行室内毒力测定试验，研究小菜蛾的抗药性。所述的苯基吡唑类药物优选为氟虫腈。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1.专利技术人经过广泛研究和反复试验，通过对基因突变位点的几次选择，增加了RDL基因靶点的长度(由N18的18碱基增加到N20的20个碱基)，以及优化了RDL基因靶点序列，提高了靶标识别精准度，从而分别敲除了小菜蛾RDL1、RDL2基因，构建了可稳定遗传的小菜蛾RDL亚基敲除品系。本方法突破了RNAi干扰技术的不可遗传，RDL基因突变后，雌雄突变体的正常交配行为均不受影响，且突变体可遗传到下一代，得到稳定遗传的有效突变后代。2.通过氟虫腈对制备的小菜蛾RDL亚基敲除品系进行室内毒力测定试验，可以为小菜蛾抗性研究提供新方法，也可用于监测小菜蛾田间种群抗药性，指导田间合理用药。附图说明图1为小菜蛾RDL基因的结构和敲除靶点分析图；其中，TS(targetsite)为选择的靶点。图2为sgRNA模板扩增引物PxRDL1-gRNAF和PxRDL2-gRNAF的可操作性元件结构图。图3为G0代突变体的PCR产物检测结果图；其中，A为RDL1突变体；B为RDL2突变体。图4为纯合系筛选路线图。图5为纯合突变体的基因型；其中，A为RDL1纯合突变体；B为RDL2纯合突变。图6为氟虫腈室内毒力测定试验结果图。具体实施例下面将结合实施方式和附图对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)利用CRISPR/Cas9系统选择RDL基因敲除靶点；/n(2)体外合成sgRNA：设计sgRNA模板的扩增引物，扩增，得到sgRNA模板，体外转录，纯化，得到sgRNA；/n(3)显微注射：将步骤(2)体外合成的sgRNA与Cas9蛋白混合，孵育，显微注射到小菜蛾卵中；/n(4)培育靶点敲除小菜蛾：将步骤(3)显微注射后的小菜蛾卵孵化，得到的G0代和同代G0代自交或者和野生型杂交，得到突变体G1代，之后对G1代连续多代自交，得到纯合突变体，即小菜蛾RDL亚基敲除品系。/n步骤(1)中所述的RDL基因敲除靶点包括：/n核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的RDL1基因敲除靶点；/n核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的RDL2基因敲除靶点；/n步骤(2)中所述的sgRNA模板的扩增引物从5’端到3’端包括以下可操作性元件：额外序列、T7启动序列、G(s)碱基，RDL基因敲除靶点序列以及sgRNA质粒模板序列；/n步骤(2)中所述的sgRNA模板的扩增引物序列PxRDL1-gRNAF和PxRDL2-gRNAF如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种制备小菜蛾RDL亚基敲除品系的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)利用CRISPR/Cas9系统选择RDL基因敲除靶点；
(2)体外合成sgRNA：设计sgRNA模板的扩增引物，扩增，得到sgRNA模板，体外转录，纯化，得到sgRNA；
(3)显微注射：将步骤(2)体外合成的sgRNA与Cas9蛋白混合，孵育，显微注射到小菜蛾卵中；
(4)培育靶点敲除小菜蛾：将步骤(3)显微注射后的小菜蛾卵孵化，得到的G0代和同代G0代自交或者和野生型杂交，得到突变体G1代，之后对G1代连续多代自交，得到纯合突变体，即小菜蛾RDL亚基敲除品系。
步骤(1)中所述的RDL基因敲除靶点包括：
核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的RDL1基因敲除靶点；
核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的RDL2基因敲除靶点；
步骤(2)中所述的sgRNA模板的扩增引物从5’端到3’端包括以下可操作性元件：额外序列、T7启动序列、G(s)碱基，RDL基因敲除靶点序列以及sgRNA质粒模板序列；
步骤(2)中所述的s...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐汉虹，王坤坤，林菲，李本杰，陈冬平，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44