一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，包括如下步骤：(1)阻隔物与生物分子结合；(2)PEG化生物分子；(3)将阻隔物与生物分子分离。另一方面，本发明专利技术公开了一种制备结合位点可控的PEG化IL‑2的方法，包括如下步骤：(1)将IL‑2与IL‑2α受体结合，封闭IL‑2的α结合位点；(2)PEG化，PEG与IL‑2偶联；(3)将IL‑2与IL‑2α受体分离。通过对IL‑2的结合位点进行调控，PEG化过程中只添加1或2个PEG，使IL‑2选择性的结合IL‑2Rβγ类受体。

【技术实现步骤摘要】
一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法
本专利技术属于医药
，具体的涉及一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法。
技术介绍
白细胞介素-2(IL-2)是由植物血凝素(PHA)等分裂原刺激淋巴细胞增殖时产生的。近来对该因子及其受体的研究日益深入，发现它在细胞免疫、体液免疫及免疫调节中起重要作用。特别是在肿瘤免疫治疗中的作用及临床意义受到许多作者的重视。IL-2大多数由CD4+的T辅助细胞(Th)产生的，少数由CD8+及其它免疫细胞产生。这些细胞在IL-1作用下能分泌IL-2。淋巴细胞产生的IL-2作用于表面带IL-2受体的细胞，使细胞增殖而发挥其生物学功能，可作用于正常T、B淋巴细胞、NK细胞的前体细胞、细胞毒T细胞(CTL)以及淋巴因子活化的杀伤细胞的前体细胞等。IL-2的生物学功能包括：1，维持活化后T细胞体外长期生存，并保持其生物学功能活性，一些受肿瘤抗原激活的T细胞在IL-2作用下，可增强其杀伤肿瘤细胞的功能，加强抗肿瘤作用；2，促进B细胞增殖，分化并产生抗体；3，刺激粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及γ-干扰素等的分泌，促进淋巴细胞表达这些受体；维特亚剂量促分裂原存在时胸腺的增殖；促进IL-2受体表达，参与机体免疫调节系统，维持免疫平衡和稳定。IL-2是最早的免疫治疗药物。早在1992和1998年，美国FDA就批准了IL-2药物阿地白介素(Aldesleukin)用于晚期肾癌和恶性黑色素瘤，有效率在15％-20％，能使近10％-15％的患者存活期超过5年。不过，由于临床使用的剂量很高，IL-2的副作用很大，比如严重的低血压和血管渗漏综合征。在当时，使用IL-2治疗的患者必须住院，24小时密切观察，稍有不慎就有生命危险。所以，巨大的副作用限制了IL-2的使用，多数临床医生并不敢轻易碰它。IL-2的作用机理如下：IL-2主要由经抗原刺激后的CD4+T细胞产生，CD8+T细胞，NK细胞和DC细胞也可以分泌。高剂量的IL-2可以促进CD4+T细胞的分化，CD8+T细胞和NK细胞的增殖，增加他们的杀伤力从而调动机体的免疫反应。反过来，低剂量的IL-2会促进调节性T细胞的增殖，对免疫系统起到抑制的作用，因此低剂量的IL-2也常常用来治疗自身免疫性疾病。之所以有此不同主要是因为免疫细胞表面IL-2受体分布不同，IL-2受体共有三个亚基构成α，β，γ亚基。CD8阳性T细胞和NK细胞等起杀伤性细胞表面受体主要是β和γ亚基构成(IL-2Rβγ)，该受体对IL-2亲和力较低，需要大剂量IL-2才能激活。而调节性T细胞表面多为α，β，γ三个亚基组成的高亲和抗体(IL-2Rαβγ)，低剂量的IL-2更容易激活他们从而起到免疫抑制作用。IL-2早在20多年前就被批准治疗肾细胞瘤和转移性黑色素瘤，却一直身处免疫治疗的冷宫，鲜有使用。究其原因主要是以下几点：1，有效率低，单用IL-2的有效率只能达到15-20％左右；2，IL-2功能双面性，低剂量IL-2促进调节性T细胞的增殖引起免疫抑制，如何调和这两个功能尚待解决；3，半衰期短，只有几分钟，想要持续起效必须要大剂量给药；4，不良反应严重，过度激活的免疫系统有可能会攻击自身脏器造成器官衰竭，剂量窗口比较窄。为了提高IL-2的疗效，降低不良反应，科学家们还尝试了各种联用方案，比如IL-2+干扰素，IL-2+淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞疗法，IL-2+化疗等，效果均不理想。最近几年，科学家们发现：在正常的IL-2分子上面添加化学修饰，可以维持IL-2的效果，同时降低使用浓度，也降低副作用。于是，NKTR-214就诞生了。NKTR-214并不神秘，本质上是一个20多年前就上市的老药IL-2的升级版，副作用更低，特异性更好(更容易激活CD8而不是Treg细胞)，可以更高效的激活免疫系统。具体的是在IL-2分子上添加6个聚乙二醇(PEG)修饰，形成了无活性的药物；神奇的是，给肿瘤患者注射之后，这6个PEG修饰会逐渐脱落，形成了有活性的2-PEG和1-PEG的形式。NKTR-214是PEG化的IL-2，原药的活性很低。六个PEG链被巧妙的连接在IL-2中可以结合IL-2Rαβγ高亲和抗体α亚基的部位，使得PEG化后的IL-2更倾向于结合在杀伤性免疫细胞中的IL-2Rβγ类受体。随着PEG逐个被降解掉，药物的活性得到缓慢的释放。NKTR-214解决了IL-2在肿瘤治疗中的两大痛点：一是通过PEG降级达到了药物缓释的效果，从而大大提高了耐受性；二是提高了对杀伤性免疫细胞的选择性，增加了微环境中免疫细胞PD-1的表达量。Nektar公司于2015年10月7日在纳斯达克宣布，已向美国食品药品监督管理局(FDA)提交NKTR-214的新药申请。该公司已完成NKTR-214的临床前研究，并计划在2015年底启动该药物的一期和二期临床研究。在临床前研究中，NKTR-214与现有的IL-2治疗药物阿地白介素相比，单剂量给药后，NKTR-214肿瘤内的AUC值是阿地白介素的近400倍。此外，Nektar公司提供的数据表明，NKTR-214在多个临床前动物模型中均表现出长效的抗肿瘤免疫治疗效果；在肿瘤浸润型淋巴细胞模型中，经NKTR-214处理后，CD8阳性T细胞与CD4阳性T细胞的比值约为450:1，表现出了强效的肿瘤杀伤作用。因此，NKTR-214是免疫刺激因子类抗癌药物，有着与抗体相近的治疗效应，可刺激T细胞的生长，从而实现对肿瘤的杀伤作用。临床前实验结果表明该药物具有长效抗肿瘤的治疗效果，是一种极具期待性的抗癌药物。但是在实际生产过程中，正常的IL-2分子上面通过化学修饰添加6个PEG形成NKTR-214，从而实现IL-2选择性的结合IL-2Rβγ类受体。在本专利技术中，申请人提供一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，在体外对生物分子的结合位点进行人为干预，保持结合位点暴露且不被PEG化的状态下，使生物分子进入体内靶向性更强，发挥治疗效果更迅速。具体的在对IL-2进行修饰时，通过对IL-2的结合位点进行调控，PEG化只添加1或2个PEG，使IL-2选择性的结合IL-2Rβγ类受体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，具体的，本专利技术提供一种制备结合位点可控的PEG化IL-2的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，包括如下步骤：(1)阻隔物与生物分子中至少一个结合位点结合；(2)PEG化生物分子；(3)将阻隔物与生物分子分离。所述步骤(1)中生物分子选自与阻隔物具有特异性结合作用的生物大分子或小分子，所述生物分子上具有至少一个阻隔物的结合位点。阻隔物与生物分子选自如下组合：配体与受体、DNA与其互补的DNA或RNA、酶与其底物、酶与其竞争性抑制剂、酶与其辅酶因子、维生素与其特异性结合蛋白、糖蛋白与其相应的凝集素等。优选的，所述配体与受体选自：激素与受体、药物与受体等。所述DNA与其互补本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，包括如下步骤：/n(1)阻隔物与生物分子中至少一个结合位点结合；/n(2)PEG化生物分子；/n(3)将阻隔物与生物分子分离；/n其中，所述步骤(1)中生物分子选自与阻隔物具有特异性结合作用的生物大分子或小分子，所述生物分子上具有至少一个阻隔物的结合位点；/n阻隔物与生物分子选自如下组合：配体与受体、DNA与其互补的DNA或RNA、酶与其底物、酶与其竞争性抑制剂、酶与其辅酶因子、维生素与其特异性结合蛋白、糖蛋白与其相应的凝集素；优选的，所述配体与受体选自：激素与受体、药物与受体。/n

【技术特征摘要】
20181227 CN 20181160760321.一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，包括如下步骤：
(1)阻隔物与生物分子中至少一个结合位点结合；
(2)PEG化生物分子；
(3)将阻隔物与生物分子分离；
其中，所述步骤(1)中生物分子选自与阻隔物具有特异性结合作用的生物大分子或小分子，所述生物分子上具有至少一个阻隔物的结合位点；
阻隔物与生物分子选自如下组合：配体与受体、DNA与其互补的DNA或RNA、酶与其底物、酶与其竞争性抑制剂、酶与其辅酶因子、维生素与其特异性结合蛋白、糖蛋白与其相应的凝集素；优选的，所述配体与受体选自：激素与受体、药物与受体。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DNA与其互补的DNA或RNA选自：基因探针与碱基互补的基因序列；
所述酶与其底物选自：蛋白酶与蛋白质、淀粉酶与淀粉、核酸酶与核酸、乳酸脱氢酶与乳酸、草酰乙酸脱羧酶与草酰乙酸；
所述酶与其竞争性抑制剂选自：琥珀酸脱氢酶与丙二酸、二氢叶酸合成酶与磺胺类药物、胆碱酯酶与有机磷农药、巯基酶与路易士气；
所述酶与其辅酶因子选自：丙酮酸脱氢酶与Mn2+、过氧化氢酶和氧化还原酶与Fe2+/Fe3+；
所述激素与受体选自：雌激素与雌激素受体、雄激素与雄激素受体、盐皮质激素与盐皮质激素受体、甲状腺激素与甲状腺激素受体、孕激素与孕激素受体；
所述药物与受体选自：胰岛素、胰岛素样生长因子、上皮生长因子、血小板生长因子及淋巴因子与具有酪氨酸激酶活性的受体、肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、M-乙酰胆碱、阿片类、嘌呤类、前列腺素及多肽激素类药物与G-蛋白偶联受体；优选的，所述药物与受体选自：叶酸与叶酸受体、IL与IL受体；
所述维生素与其特异性结合蛋白选自：维生素A与视黄醇结合蛋白、维生素D与维生素D结合蛋白、α-生育酚与α-生育酚转运蛋白、维生素K与脂蛋白；
所述糖蛋白与其相应的凝集素选自：辣根过氧化物酶与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素、木菠萝素与半乳糖、苋科凝集素与N-乙酰半乳糖胺、二聚体几丁质结合凝集素与N-乙酰氨基葡萄糖寡聚糖、双花扁豆素与血型A物质、荆豆凝集素与血型O物质2-L-岩藻糖。


3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述药物与受体选自：IL-2与IL-2受体，IL-2受体包括IL-2α受体、IL-2β受体、IL-2γ受体。


4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中将阻隔物与生物分子分离的方法包括：离心分离、沉淀分离、过滤分离、泡沫分离、萃取分离、膜分离、层析分离、电泳分离、梯度洗脱中的一种或两种以上的组合。


5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中PEG化的生物分子具有如下结构：



m为1-12的整数，具体可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；
X为PEG与生物分子之间的连接基团，选自：-(CH2)a-、-(CR1R2)a-、-(CH2)aNH-、-NHCO(CH2)a-、-(CH2)aCONH-、-(CH2)aCO-、-CO(CH2)a-、-(CH2)aCONH(CH2)a-、-(CH2)a-S-S-(CH2)a-、-(CH2)aCOO(CH2)a-、-(CH2)a-S-(CH2)a-中的一种或多种的组合；
a为0-10的整数；
R1和R2独立地选自：-H、C1-6的烷基、-OR'、-NHR'、-N(R')2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-COR'、-COOR'、-OCOR'、-CONHR'或-CON(R')2中的一种或多种的组合；
R'选自：-H、C1-6的烷基、-F、-Cl、-Br或-I；
所述PEG为直链、Y型、多分支的聚乙二醇残基，例如包括单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、直链双端PEG、Y型PEG、4臂支链PEG、6臂支链PEG或8臂支链PEG，PEG的分子量为1-100KDa。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述a为0-5的整数；
R1和R2独立地选自：H、C1-3的烷基、-OH、C1-3的烷氧基、-NH2、-F、-Cl、-Br和-I中的一种或多种的组合；
R'选自：-H和C1-3的烷基；
所述PEG为直链聚乙二醇残基，具有通式Ⅱ或Ⅲ所示的结构：



其中p和q独立的选自1-2280的整数；
或所述PEG为Y型聚乙二醇残基，具有通式Ⅳ或Ⅴ所示的结构：



其中，i和h独立的选自1-1140的整数；

【专利技术属性】
技术研发人员：王庆彬，齐杰，李玉，赵宣，
申请(专利权)人：天津键凯科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12