一种向细胞内传递外源性分子的方法技术

本发明专利技术涉及一种向细胞内传递外源性分子的方法。所述方法包括使用表面沉积有改性聚多巴胺层的基材，所述改性聚多巴胺层是由含双键的功能性聚多巴胺与温敏聚合物单体进行反应获得的温敏聚合物接枝改性的聚多巴胺层。所述方法通用性强、传递效率和转染效率高、细胞毒性小、改造细胞收获率高、一次性细胞处理通量大。

A method of transferring exogenous molecules into cells

【技术实现步骤摘要】
一种向细胞内传递外源性分子的方法
本专利技术涉及生物医学和医疗器械领域，具体涉及一种向细胞内传递外源性分子的方法。
技术介绍
向细胞内传递外源性大分子，如核酸、蛋白质和细胞内探针等，在基础生物研究、工业生产以及临床诊断和治疗中都具有重要作用。目前，向细胞内传递外源性大分子的方法主要可分为载体法和破膜法两种。载体法是指利用一些物质作为载体，包裹外源性分子，保护其进入细胞后不被降解并促进其与细胞膜之间的相互作用，最终护送外源性分子进入细胞之中。其中载体可以是带有生物活性的重组病毒、小泡、影细胞、功能性配体和多肽等，也可以是合成的聚合物和纳米粒子。病毒载体通过病毒感染的方式将外源性分子送入细胞，而其他大部分载体都通过胞吞或膜融合的方式进入细胞中。其中最具代表性的载体包括腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒、聚乙烯亚胺、金纳米粒子、商业化的转染试剂Lipofectamine2000、Lipofectamine3000等。破膜法是指利用化学破膜剂(洗涤剂等)或物理外力(力、声、光、电、热等)使细胞膜表面通透性增强或产生孔洞，帮助外源性分子进入细胞。最具代表性且发展最为成熟的物理破膜法有电穿孔法和显微注射法。电穿孔法是利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成有利于核酸进入的微孔，而显微注射法是将外源性物质直接通过显微注射装置导入细胞之中。如今，病毒载体由于效率高且特异性好被认为是最有效的细胞内分子传递方法。但也正是由于病毒的强感染性，导致病毒载体的使用带来极大的安全隐患。另外，病毒载体仅局限于用于核酸物质的传递，而无法用来向细胞内传递其他的外源性分子，因为只有遗传物质才能被整合到病毒的基因组内进行后续的宿主感染实验。而这一问题，也同样存在于其他载体法中。由于外源性分子首先需要与载体通过一定的相互作用(如静电相互作用)进行结合，这就对外源性分子的性质带来了一定限制，即某种载体只能用于传递某种带有特定性质的分子，使载体法的通用性大打折扣。虽然现在也有用载体法来传递蛋白质或是其他药物分子的研究，但大部分载体仍然局限于核酸物质的传递，通用性相对较强且可以传递多种不同分子的载体并不存在。此外，载体法不仅对可传递分子的种类较为局限，对可处理的细胞种类更是有限。尤其是对于难转染细胞，其转染效率非常低。这主要是因为难转染细胞的自我保护机制更强，载体难以进入细胞。虽然部分载体法可以通过修饰一些细胞特异性多肽等方式来提高载体进入细胞的效率，但这只是提高了特定细胞系的转染效率，在可传递的细胞种类方面依然受限。因此，载体法主要存在以下几个缺点：(1)病毒载体转染效率高，但是安全问题不容忽视，且只可用于核酸物质的传递；(2)非病毒载体可传递分子种类和可传递细胞种类方面的通用性较低，且对于难转染细胞的转染效率很低。另一方面，物理破膜法由于会破坏细胞膜的完整性，因此通常会对细胞的活性造成较大的损伤。比如电穿孔法中，为了使核酸物质有效进入细胞内部，所使用的高压电脉冲往往导致大量细胞死亡，使最后可应用的有效细胞数量大大减少。而在显微注射方法中，虽然可以有效地将核酸物质导入细胞核，但其只适合单细胞操作，而不适合用于大通量地处理细胞。其它利用物理外力进行细胞破膜的一些方法大多需要复杂的仪器或装置，使实验门槛变得较高。CN105420278A公开了采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子细胞的方法及制备该细胞用的基材及该细胞。其研发了一种基于金纳米粒子沉积膜的光致穿孔试剂盒，利用粘附于其表面的细胞在激光照射下细胞膜通透性的增强，向细胞内传递多种外源性大分子。但该方法对于难转染的细胞系，其转染效率还有待提升，例如原代细胞小鼠胚胎成纤维细胞，该方法在没有载体的情况下的转染效率大概在53％左右。另外，金纳米粒子沉积膜表面粗糙度大，表面拓扑结构复杂，细胞与表面的粘附力很强，导致改造后的细胞难以收获，对后续应用造成了限制。而如果采用胰酶消化收获细胞，将对细胞活性造成极大的损伤，尤其是脆弱的原代细胞。总的来说，物理破膜法主要存在的缺点包括细胞活性损失大、细胞处理通量低、所需仪器装置复杂和细胞收获效率较低等。因此，一种外源性分子和细胞种类通用性强、传递效率高、细胞毒性小、可大通量处理细胞且细胞收获率高的大分子传输体系还有待研究。
技术实现思路
专利技术要解决的问题为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术设计一种通用性强、传递效率和转染效率高、细胞毒性小、改造细胞收获率高、一次性细胞处理通量大的向细胞内传递外源性分子的方法。用于解决问题的方案在一个技术方案中，本专利技术提供了一种向细胞内传递外源性分子的方法，所述方法包括将表面沉积有改性聚多巴胺层的基材和所述细胞接触，所述改性聚多巴胺层是由含双键的功能性聚多巴胺或功能性多巴胺单体与温敏聚合物单体进行反应所获得。在一个实施方式中，所述方法包括将所述细胞种植在所述表面沉积有改性聚多巴胺层的基材的表面，使所述细胞与含有外源性分子的试剂接触，用近红外波段的激光光源照射细胞。更进一步地，所述方法还包括将激光照射后的所述表面沉积有改性聚多巴胺层的基材放置于低于所述温敏聚合物低临界溶液温度的环境中，促使细胞从表面脱附。在另一个实施方式中，所述方法还包括配制含有多巴胺和/或多巴胺盐酸盐以及烯属不饱和酸酐的水溶液，pH调节至弱碱性，优选地pH为8-9，将基材浸没于溶液中获得表面沉积有功能性聚多巴胺的基材的步骤。在另一个实施方式中，所述方法还包括将多巴胺和/或多巴胺盐酸盐以及烯属不饱和酸酐溶解在水中搅拌，获得含双键的功能性多巴胺单体的步骤。在另一个实施方式中，所述烯属不饱和酸酐选自衣康酸酐、马来酸酐、柠康酸酐中的一种或多种，优选地，所述烯属不饱和酸酐选自衣康酸酐。在另一个实施方式中，本专利技术所述温敏聚合物单体至少包括N-异丙基丙烯酰胺，进一步优选地，所述温敏聚合物单体为N-异丙基丙烯酰胺。在另一个实施方式中，本专利技术所述基材可为金属材料(如金、不锈钢、钛合金、镁合金等)、无机非金属材料(如单晶硅、云母、玻璃等)、有机高分子材料(如聚氨酯、聚二甲基硅氧烷、聚合物电纺纤维膜等)、实验或仪器装置(细胞培养板、酶标板、微流道装置)等，优选地，所述基材为金片。在另一个实施方式中，本专利技术所述外源性分子包括多糖分子(如右旋糖酐)、蛋白质(如基因编辑酶、抗体、抗原)、DNA(如pDNA)、RNA(如miRNA、siRNA)、治疗性药物、细胞内探针(如量子点)、纳米材料(如纳米粒子、纳米装置)、适配体、细菌、人造染色体、细胞器(如线粒体)等中的一种或多种。在另一个实施方式中，本专利技术所述细胞选自细胞系或原代细胞，优选地，所述细胞系包括海拉细胞，所述原代细胞系包括小鼠胚胎成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞、小鼠树突状细胞中的一种。在另一个技术方案中，本专利技术还提供了表面沉积有改性聚多巴胺层的基材在向细胞内传递外源性分子过程中的用途，所述改性聚多巴胺层是由含双键的功能性聚多巴胺或功能性多巴胺单体与温敏聚合物单体进行反应所获得。在另一个技术方案中，本专利技术还提供一种采用本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种向细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述方法包括将表面沉积有改性聚多巴胺层的基材和所述细胞接触，所述改性聚多巴胺层是由含双键的功能性聚多巴胺或功能性多巴胺单体与温敏聚合物单体进行反应所获得。/n

【技术特征摘要】
1.一种向细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述方法包括将表面沉积有改性聚多巴胺层的基材和所述细胞接触，所述改性聚多巴胺层是由含双键的功能性聚多巴胺或功能性多巴胺单体与温敏聚合物单体进行反应所获得。


2.根据权利要求1所述的一种向细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述方法包括将所述细胞种植在所述表面沉积有改性聚多巴胺层的基材的表面，使所述细胞与含有外源性分子的试剂接触，用近红外波段的激光光源照射细胞。


3.根据权利要求2所述的一种向细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述方法还包括将激光照射后的所述表面沉积有改性聚多巴胺层的基材放置于低于所述温敏聚合物低临界溶液温度的环境中。


4.根据权利要求1-3任一项所述的一种向细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述方法还包括配制含有多巴胺和/或多巴胺盐酸盐以及烯属不饱和酸酐的水溶液，pH调节至弱碱，优选地pH为8-9，将基材浸没于溶液中获得表面沉积有功能性聚多巴胺的基材的步骤；或者，所述方法还包括将多巴胺和/或多巴胺盐酸盐以及烯属不饱和酸酐溶解在水中搅拌，获得带有双键的功能性多巴胺单体的步骤。


5.根据权利要求4所述的一种向细胞内传递外源性分子的方法，其特征在于，所述烯属不饱和酸酐选自衣康酸酐、马来酸酐、柠康酸酐中的一种或多种，进一步优选地，所述烯属不饱和酸酐选自衣康酸酐。


6.根据权利要求1-5任一项所述的一种向细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红，于谦，吴静娴，
申请(专利权)人：江苏百赛飞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32