当前位置: 首页 > 专利查询>马信龙专利>正文

基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统及应用技术方案

技术编号:24325383 阅读:64 留言:0更新日期:2020-05-29 17:56
本发明专利技术提供了一种基于CRISPR‑Cas13的RNA编辑系统及其应用,所述系统包括靶向元件、编辑效应元件和向导元件;其中,所述靶向元件包含刺激响应蛋白A和失活型Cas13酶(dCas13),所述编辑效应元件包括刺激响应蛋白B和RNA编辑效应蛋白;所述刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B在刺激作用下相互结合,刺激消失后解除结合;本发明专利技术首次提出了光控RNA编辑的概念,将光遗传学与RNA编辑相结合,构建了基于CRISPR‑Cas系统的光控RNA编辑系统,实现了RNA编辑的精准时空调控,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

RNA editing system based on crispr-cas13 and its application

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统及应用
本专利技术属于生物
,涉及一种基因编辑方法,尤其涉及一种基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统及其应用。
技术介绍
核糖核酸(RibonucleicAcid,RNA),是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体,在生命过程中发挥至关重要的作用,主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达,是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。表观转录组学(Epitranscriptomics)是近来兴起的热门领域之一,主要研究RNA所携带的化学修饰对基因表达的影响。迄今为止,在RNA上已发现了一百多种化学修饰。这些修饰大量分布在非编码RNA,特别是rRNA,tRNA和snRNA上,为ncRNA在翻译与剪接中发挥正常功能所必需。其中m6A(N6-methyladenosine)及A-to-I(inosine)是最常见的两种RNA修饰方式,这些修饰也分布在真核生物mRNA上,影响mRNA的代谢与功能。特别是伴随着许多mRNA修饰酶(Writer)、去修饰酶(Eraser)和修饰识别蛋白(Reader)的新发现,mRNA化学修饰的可逆变化与动态调控重新激起了研究人员的兴趣,受到越来越多的关注。尽管RNA修饰对于其功能有重要影响,但目前尚无有效的方法对特定基因的化学修饰进行精准调控。转录后调控对于基因表达的精准协作起到至关重要的作用,目前能够对RNA进行编辑的方法主要包括:1.基于CRPSR-Cas系统的方法。Cas9被广泛用于基因组DNA的编辑,它具有DNA酶的活性但不具备RNA酶活性。近期有学者对Cas9系统进行改进,通过引入一段短的DNA寡核苷酸与目的RNA序列结合,从而产生Cas9发挥功能所必须的PAM序列,使得Cas9能够识别并作用于单链RNA(1)。通过进一步优化该系统,Cas9能够用于内源性mRNA的示踪,抑制mRNA的翻译等(2)。目前研究发现Cas13主要包括Cas13a,Cas13b及Cas13d。其中Cas13a是首个发现以RNA作为向导具备靶向RNA酶的CRISPR-Cas系统,它具备单链RNA识别及剪切的功能。Cas13d特点为分子量在四者间最小(930个氨基酸组成),便于慢病毒及腺相关病毒的包装,同时具备更显著的RNA敲低效果。Cas13b目前被用于进行靶向RNA编辑。Cox等研究者将失活的Cas13b(dCas13b)与ADAR2融合,从而实现了活细胞内特定位点的RNA编辑(3)。Rauch等人将dCas13b与m6A识别蛋白(YTHDF1和YTHDF2)相融合从而能够研究m6A修饰对于特定转录本的影响(4)。近期Xiao-MinLiu等基于CRIPSR-Cas9系统开发了特定RNAm6A编辑的新工具。研究者将失活的Cas9(dCas9)与m6A甲基化酶及去甲基化酶分别融合,然后连同向导RNA及短链DNA寡核苷酸(与RNA碱基互补配对结合形成PAM序列)共同导入细胞内,能够实现细胞内特定位点的RNAm6A编辑(5)。但该方案无法实现特定RNA修饰的时空调控,CRISPR系统导入细胞内后会持续发生作用,这无法满足复杂生物学行为的精准调控要求。2、基于RNA结合蛋白的方法。RNA结合蛋白对于RNA的调控及代谢至关重要,它能够通过识别RNA中特定的结构域并与之结合。PUF是人源Pumilio1(PUM1)蛋白的RNA结合结构域截短体。PUF蛋白以特定方式识别其RNA靶点。利用PUF的这种RNA识别、结合功能,将其与各种功能模块融合在一起,能够发挥不同的特异性功能。近期报道的CIRTS(CRISPR-Cas-inspiredRNAtargetingsystem)系统,由单链RNA结合蛋白ORF5,HBEGF,b-defensin3,RNA发卡结构结合蛋白TBP,SLBP及不同的效应蛋白(Pin核酸酶,YTHDF1,YTHDF2,ADAR2)组成,该系统体积小,无免疫原性,可操控性强,为研究RNA修饰提供了一个简便的平台(6)。现有研究报道使用CRISPR-Cas9系统融合m6A甲基化酶或去甲基化酶能够实现对不同RNA区域中的单个位点进行m6A编辑(5);dCas13融合m6A识别蛋白能够用于解释m6A修饰对单个转录本的影响(4);dCas13融合RNA腺苷脱氨酶(ADAR)可以实现特定的A-to-I编辑(3);进一步简化设计的guideRNA能够引导ADAR实现精确的A-to-IRNA编辑(7);受CRISPR-Cas系统启发进一步优化的CIRTS系统提供了一个研究RNA调控的平台(6)。这些方法不仅扩大了RNA编辑的范围,同时大大促进了研究人员对于RNA调控的理解。可是,这些系统均无法实现RNA编辑的精准时空调控,而这一点对于理解RNA的动态功能及与细胞表型之间关系是至关重要的。尽管RNA修饰对于其功能有重要影响,但目前尚无有效的方法对特定基因的化学修饰进行精准调控。因此,研发一种能够对特定基因的化学修饰进行精准调控的系统及方法,对于RNA编辑领域具有重大意义和研究价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求,本专利技术提供一种基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统及其应用,通过将光遗传学与RNA编辑相结合,构建了基于CRISPR-Cas系统的光控RNA编辑系统,实现了RNA编辑的精准时空调控,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。本专利技术要解决的关键问题为实现特定RNA位点化学修饰的高效调控,结合光遗传学及CRISPR-Cas13基因编辑技术,实现RNA化学修饰的时间、空间双重调控。为达此目的,本专利技术采用以下技术方案:第一方面,本专利技术提供一种基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统,所述系统包括靶向元件、编辑效应元件和向导元件;其中,所述靶向元件包含刺激响应蛋白A和失活型Cas13酶(dCas13),所述编辑效应元件包括刺激响应蛋白B和RNA编辑效应蛋白;所述刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B在刺激作用下相互结合,刺激消失后解除结合。优选地,所述刺激包括光刺激、化学刺激或磁场刺激。优选地,所述光刺激的光包括蓝光、紫外光、近红外或绿光中的任意一种。优选地,当所述刺激为光刺激时,所述刺激响应蛋白A和刺激响应蛋白B为光敏蛋白。所述光敏蛋白包括CIB1(或其截短体CIBN)、CRY2(或其截短体CRY2PHR,CIB1与CRY2是一对刺激响应蛋白)、pMag、nMag(pMag与nMag是一对刺激响应蛋白)、Lov2、PhyB、PIF3(PhyB与PIF3是一对)、BphP1、PpsR2、Q-PAS1(BphP1与PpsR2是一对;BphP1与Q-PAS1是一对)、UVR8和COP1(UVR8与COP1是一对)中的任意一种或至少两种的组合。优选地,所述失活型Cas13酶包括dCas13a,dCas13b或dCas13d中的任意一种或至少两种的组合。优选地,所述失活型Cas13酶为dCas13b。所述RNA编辑效应蛋白包括去甲基化酶或甲基化酶中的本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统,其特征在于,所述系统包括靶向元件、编辑效应元件和向导元件;/n其中,所述靶向元件包含刺激响应蛋白A和失活型Cas13酶(dCas13),所述编辑效应蛋白包括刺激响应蛋白B和RNA编辑效应蛋白;/n所述刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B在刺激作用下相互结合,刺激消失后解除结合。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas13的RNA编辑系统,其特征在于,所述系统包括靶向元件、编辑效应元件和向导元件;
其中,所述靶向元件包含刺激响应蛋白A和失活型Cas13酶(dCas13),所述编辑效应蛋白包括刺激响应蛋白B和RNA编辑效应蛋白;
所述刺激响应蛋白A与刺激响应蛋白B在刺激作用下相互结合,刺激消失后解除结合。


2.根据权利要求1所述的RNA编辑系统,其特征在于,所述刺激包括光刺激、化学刺激或磁场刺激;
优选地,所述光刺激的光包括蓝光、紫外光、近红外或绿光中的任意一种;
优选地,当所述刺激为光刺激时,所述刺激响应蛋白A和刺激响应蛋白B为光敏蛋白;
所述光敏蛋白包括CIB1或其截短体CIBN、CRY2或其截短体CRY2PHR、pMag、nMag、Lov2、PhyB、PIF3、BphP1、PpsR2、Q-PAS1、UVR8或COP1中的任意一种或至少两种的组合。


3.根据权利要求1或2所述的RNA编辑系统,其特征在于,所述失活型Cas13酶包括dCas13a、dCas13b或dCas13d中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述Cas13酶为dCas13b。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的RNA编辑系统,其特征在于,所述RNA编辑效应蛋白包括去甲基化酶或甲基化酶中的任意一种;
优选地,所述去甲基化酶包括FTO或ALKBH5去甲基化酶中的任意一种;
优选地,所述甲基化酶包括M3M14甲基化转移酶结构域;
优选地,所述向导元件为Cas13b向导RNA。


5.根据权利要求1-4中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员:马信龙赵杰
申请(专利权)人:马信龙赵杰
类型:发明
国别省市:天津;12

相关技术
    暂无相关专利
网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1