一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法。具体是在莱茵衣藻突变体文库建立后直接进行细胞周期调控缺陷突变体，初筛根据单克隆直径大小，复筛再利用酶标仪OD

A method of screening mutants with cycle regulation defects in Chlamydomonas reinhardtii

【技术实现步骤摘要】
一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法。
技术介绍
莱茵衣藻是一种单细胞真核藻类，特点在于生长迅速，世代周期短，细胞周期调控方式简单，易于培养，能用TAP液体培养基吹气培养，也能在平板上生长单克隆等优点而被选为模式生物，广泛用来研究光合作用，脂质代谢，纤毛运动，细胞分裂等过程。前人的研究也已经证明了衣藻的重要研究价值就是其简单的突变体获取方式，如1930年Moiwus就已经能成功分离衣藻细胞的突变体。现如今更是可以通过电转的方法来高效快速获取大量突变体，并以此为基础来从中筛选感兴趣性状的突变体。衣藻细胞周期调控涉及到衣藻纤毛去组装、释放中心体、形成纺锤体，以及后续的细胞分裂等的调控，每一个环节的缺陷都会造成周期的紊乱，从而影响其增殖。因此，在衣藻体系中，其纤毛周期与其细胞周期又是相互偶联的，因此为了探索纤毛周期的异样，可以以衣藻细胞周期异常的为突破口来对其进行深入性的研究。多种其他种系的细胞作为研究细胞周期调控的报道很多，但是以衣藻作为实验材料来研究细胞周期调控缺陷，其自身具有很多优势：1.衣藻在光照或者黑暗条件下均可生长，既可以异养又可以自养；2.衣藻属于单倍体，突变体的制备和筛选相对而言比较容易，可用各种筛选基因（如，aphVIII基因、ARG7基因、NIT1基因、ble基因等等）；3.衣藻的细胞周期与纤毛周期相偶联，对于研究纤毛的研究者更加有实际意义；4..衣藻基因组测序已全部完成并且不断更新，“Phytozomev12.1:Home”有衣藻基因组序列信息，方便突变体筛选后续的序列比对（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmL）。根据之前所报道的衣藻细胞浓度可以通过吸光值OD434间接反映，专利技术人建立了本专利技术中衣藻细胞OD434标准曲线。本专利技术通过专利技术人所建立的随机插入突变体文库，而后经过初筛根据单克隆直径大小，复筛再利用酶标仪OD434检测细胞浓度，从而计算24h与48h的吸光值比值，从而参照野生型复制比，筛选和鉴定衣藻细胞周期调控缺陷的突变体的方法。该方法操作简便，效率较高，能够快速且稳定的获得细胞周期调控缺陷的突变体，为后续的实验打下了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种稳定高效筛选和鉴定衣藻细胞周期调控缺陷突变体的方法。该方法可实现高效获得大量具有稳定遗传特性的衣藻突变体藻株，也验证了酶标仪可以通过测量两个时间点的衣藻细胞浓度，能够快捷的筛选和鉴定出细胞周期调控缺陷的衣藻，同时具备操作方法简便、易于推广应用、耗费时间短等优点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法，包括以下步骤：步骤1，配制TAP液体培养基、TAP固体培养基、含巴龙霉素的TAP固体培养基，备用；步骤2，将莱茵衣藻21gr接种于TAP液体培养基中，在22.5-23.5℃、8000Lx光强下连续光照并通气培养，经过转接与继续培养、处理后，即可进行转化；步骤3，采用电击法向衣藻细胞中插入筛选基因片段aphVIII，造成随机位点突变，涂布于含巴龙霉素的TAP固体培养基平板，经过7-10天光周期培养，得到突变体文库单克隆藻；步骤4，挑取直径异常的单克隆藻落转移至TAP固体培养基平板，进行培养；步骤5，挑取步骤4培养的藻24孔板进行培养后，再利用酶标仪OD434检测24h与48h两个时间点的藻液吸光值，计算吸光值比值，记为复制比，以未进行突变的野生型的复制比为标准，筛选获得在同样的时间段内复制比明显低于或高于野生型的，即得到目标周期调控缺陷突变体。进一步地，所述TAP液体培养基的组成为：25mL/L的TAP盐溶液、0.375mL/L的磷酸盐溶液、1mL/L的Hutner微量元素溶液、1mL/L的乙酸、2.42g/L的Tris；其中：TAP盐溶液的组成为：NH4Cl15g/L、MgSO4•7H2O4g/L、CaCl2•2H2O2g/L；磷酸盐溶液的组成为：K2HPO4288g/L、KH2PO4144g/L；Hutner微量元素溶液的组成为：EDTA二钠盐50g/L、ZnSO4•7H2O22g/L、H3BO311.4g/L、MnCl2•4H2O5.06g/L、CoCl•6H2O1.61g/L、CuSO4•5H2O1.57g/L、(NH4)6Mo7O24•4H2O1.1g/L、FeSO4•7H2O4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0；所述TAP固体培养基是向TAP液体培养基中加入15g/L琼脂粉后灭菌倒平板制成；所述含巴龙霉素的TAP固体培养基（即TAP+Paro平板）是向TAP液体培养基中加入15g/L琼脂粉后灭菌，冷却至55°C后添加终浓度为10μg/mL巴龙霉素倒平板制成。进一步地，电击法是使用电击仪BTXECM830，设置参数为500V、4ms、6波段，间隔时长100ms，进行电击。进一步地，所述筛选基因片段aphVIII是从大小为6.6Kb的pJMG-aphVIII质粒中，经过内切酶EcoRI酶切，回收获得的大小为2.2Kb的抗巴龙霉素片段。进一步地，步骤2中具体是将野生型莱茵衣藻21gr接种于TAP液体培养基中，在22.5-23.5℃、8000Lx光强下连续光照并通气培养3-4天，转接过程是使得藻液初始浓度为1×106个/mL，在上述下条件下吹气培养20h，终浓度达5×106个/mL进行转化。进一步地，步骤3中培养是在22.5-23.5℃，按白天14h、夜晚10h的光周期，8000Lx光强下倒置培养7-10天。进一步地，步骤4中培养是在22.5-23.5℃，按白天14h、夜晚10h的光周期，8000Lx光强条件下倒置培养3-5天。进一步地，步骤5中培养是在TAP液体培养基中，22.5-23.5℃，按白天14h、夜晚10h的光周期，8000Lx光强条件下摇床培养。有益效果：本专利技术利用方波电击法随机插入抗性基因获得大量稳定遗传的突变体，再用酶标仪检测细胞数量变化的速度，以此来筛选和鉴定衣藻细胞周期调控缺陷的突变体。方波电击法可以高效获得大量随机插入的转化子，可挑选出大量的细胞周期调控缺陷的突变体衣藻以供后续试验进行研究，通过实验验证了酶标仪测量衣藻细胞数量的可行性，酶标仪测量精确快捷，操作方法简单，耗时短等。方波电击法能够进行莱茵衣藻高效建库，获得大量随机插入的转化子，酶标仪可准确快捷的测量衣藻细胞数量，可获得大量的细胞周期调控缺陷的突变体衣藻以供后续研究，操作方法简短，易于推广应用，具有良好的使用前景。本专利技术所采用的方波电击法建库，酶标仪测定细胞数量未曾报道用于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的细胞周期调控缺陷的筛选与鉴定。本专利技术能够方便、高效，可筛选获得大量衣藻细胞周期调控缺陷的突变体，为后续的进一步研究打下基础。附图说明...

【技术保护点】
1.一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1，配制TAP液体培养基、TAP固体培养基、含巴龙霉素的TAP固体培养基，备用；/n步骤2，将莱茵衣藻21gr接种于TAP液体培养基中，在22.5-23.5℃、8000 Lx光强下连续光照并通气培养，经过转接与继续培养、处理后，即可进行转化；/n步骤3，采用电击法向衣藻细胞中插入筛选基因片段

【技术特征摘要】
1.一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，配制TAP液体培养基、TAP固体培养基、含巴龙霉素的TAP固体培养基，备用；
步骤2，将莱茵衣藻21gr接种于TAP液体培养基中，在22.5-23.5℃、8000Lx光强下连续光照并通气培养，经过转接与继续培养、处理后，即可进行转化；
步骤3，采用电击法向衣藻细胞中插入筛选基因片段aphVIII，造成随机位点突变，涂布于含巴龙霉素的TAP固体培养基平板，经过7-10天光周期培养，得到突变体文库单克隆藻；
步骤4，挑取直径异常的单克隆藻落转移至TAP固体培养基平板，进行培养；
步骤5，挑取步骤4培养的藻24孔板进行培养后，再利用酶标仪OD434检测24h与48h两个时间点的藻液吸光值，计算吸光值比值，记为复制比，以未进行突变的野生型的复制比为标准，筛选获得在同样的时间段内复制比明显低于或高于野生型的，即得到目标周期调控缺陷突变体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述TAP液体培养基的组成为：25mL/L的TAP盐溶液、0.375mL/L的磷酸盐溶液、1mL/L的Hutner微量元素溶液、1mL/L的乙酸、2.42g/L的Tris；
其中：TAP盐溶液的组成为：NH4Cl15g/L、MgSO4•7H2O4g/L、CaCl2•2H2O2g/L；磷酸盐溶液的组成为：K2HPO4288g/L、KH2PO4144g/L；Hutner微量元素溶液的组成为：EDTA二钠盐50g/L、ZnSO4•7H2O22g/L、H3BO311.4g/L、MnCl2•4H2O5.06g/L、CoCl•6H2O1.61g/L、CuSO4•5H2O1.57g/L、(NH4)6Mo7O24•4H2O1.1g/L、Fe...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亮，温馨，李春红，王雯，陆军，郑元林，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32