一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了所述多克隆抗体在鉴定牛筋草对除草剂草甘膦抗药性上的应用；本应用具有检测周期短、灵敏度高、特异性强的优点，在牛筋草对草甘膦靶标抗性的检测和研究中具有重要的应用前景。本发明专利技术首次揭示了牛筋草PFK蛋白与除草剂草甘膦抗性之间的关系，可以通过检测PFK蛋白的含量来鉴定牛筋草对除草剂草甘膦是否产生靶标扩增抗性。本方法可快速鉴定抗性，并为科学选药防除牛筋草缓解牛筋草对草甘膦的抗性产生与蔓延具有指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体，以及该多克隆抗体的制备方法和用途。
技术介绍
牛筋草是世界十大恶性杂草之一，属一年生禾本科穇属植物，分布于全世界温带和热带地区，在我国南北各省均有分布，多生于果园、草坪、菜地等多种作物田。牛筋草的根系发达，繁殖能力强，成熟的牛筋草单株可产生近14万粒种子。以上特征使得牛筋草对农作物造成了严重的经济损失。草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，能够有效的防除牛筋草等一年生及多年生杂草。草甘膦在我国有40多年的应用历史，主要应用于非耕地、农作物保护性喷雾等。在牛筋草危害严重的地区，草甘膦是常用的防除药剂。长时间的应用使得我国的牛筋草种群对草甘膦产生了较为严重的抗药性。而在生产中由于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增大草甘膦的用药剂量，增加了成本。因此，及时鉴定出抗草甘膦的牛筋草，采取措施及时对其进行防除，对于农民收入和国家粮食安全都有重要的意义。草甘膦作用于植物的莽草酸代谢途径，其靶标酶是5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。草甘膦是一种竞争性抑制剂，他与EPSPS的催化底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)空间结构相似，抢占PEP与靶标酶EPSPS的结合位点，抑制该酶的催化功能，导致植物所必需的三种氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)合成受阻而死亡。磷酸果糖激酶(PFK)是能量代谢途径糖酵解途径的关键酶与限速酶。磷酸果糖激酶(PFK)的活性直接影响下游产物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的含量。杂草对草甘膦的靶标抗性机制分为靶标突变和靶标酶过量表达两种。目前，检测杂草对草甘膦的靶标抗性机制主要通过检测靶标基因EPSPS的突变和该酶的表达量。检测EPSPS的突变位点一般需要精密的测序仪器，成本较高。EPSPS酶活的检测则需要大量的试剂，过程繁琐，且酶的提取等过程对环境及操作要求较高。因此需要提供一种成本低、操作简便且快速准确检测牛筋草对草甘膦抗药性的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速准确检测牛筋草对草甘膦抗药性的方法。本专利技术的另一目的是提供一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术首先提供牛筋草PFK蛋白在评价牛筋草对草甘膦抗药性中的应用。本专利技术进而提供了检测牛筋草PFK蛋白的试剂或试剂盒在鉴别对草甘膦具有抗性的牛筋草中的应用。进一步地，本专利技术提供了一种用于诱导牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的抗原多肽，其氨基酸序列为以下：(1)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或(2)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。上述抗原多肽的编码基因如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了含有上述抗原多肽编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、表达载体或宿主菌。优选地，所述表达载体是pGEX-4T-1。本专利技术提供了上述抗原多肽或生物材料在制备检测牛筋草PFK蛋白或其表达量的试剂或试剂盒中的应用。优选所述的试剂为抗体。本专利技术提供一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体。该多克隆抗体由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的抗原多肽诱导而成，特异性好、效价高。本专利技术提供了上述牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)构建含有所述核苷酸序列(SEQIDNO.2)的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原；(2)将所述重组蛋白抗原免疫动物，经血清分离纯化获得牛筋草PFK多克隆抗体。含有所述牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的试剂盒属于本专利技术的保护范围。本专利技术的用于检测PFK蛋白的试剂盒包括但不限于ELISA试剂盒、酶免疫层析检测试剂盒、化学发光检测试剂盒以及免疫荧光检测试剂盒。在本专利技术的一个具体的实施方式中，为ELISA检测试剂盒，该试剂盒中可以包括样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照以及阴性对照。阳性对照可以是原核或真核表达的纯化的PFK蛋白；阴性对照可以是牛筋草的其他蛋白。用于检测牛筋草PFK蛋白的ELISA检测试剂盒的制备方法可以包括以下步骤：(1)利用本专利技术所述的PFK蛋白的多克隆抗体，将其在酶标板上进行包被。(2)配制样品稀释液、洗涤液、显色液A液、显色液B液、终止液，制备阳性对照以及阴性对照；(3)组装成ELISA检测试剂盒。优选的，在本专利技术的所述ELISA检测试剂盒的制备方法中，所述步骤(2)中包被时所用的包被液可以为碳酸盐缓冲液，优选为pH7.3的碳酸盐缓冲液。本专利技术提供了所述牛筋草PFK蛋白多克隆抗体或所述的试剂盒在检测具有草甘膦抗性的牛筋草中的应用。具体地，所述的应用包括检测PFK蛋白在植株中的含量来判断不同牛筋草材料对除草剂草甘膦的抗性。牛筋草体内EPSPS蛋白过量表达会引起其对除草剂草甘膦产生抗药性。要科学的防治抗草甘膦的牛筋草，首先需要根据其机制检测抗性是否存在。现有技术的方法是检测EPSPS的表达量，且现有技术没有发现PFK与EPSPS之间存在表达或酶含量的定量关系。本领域公知，不同的抗性基因在抗性植株中是相互独立的，即：一种或几种抗性基因可能同时或单独存在于杂草中，都能引起抗性，但是抗性基因之间没有关联。而本专利技术研究发现，发生EPSPS过量表达的牛筋草，PFK蛋白也存在过量表达现象，且与EPSPS蛋白的含量成正相关线性关系。利用蛋白质免疫印迹分析的方法检测磷酸果糖激酶(PFK)的活性，可以快速检测牛筋草因靶标过量表达而对草甘膦产生的抗药性。但是有关于牛筋草磷酸果糖激酶(PFK)的抗体却未见报道。本专利技术根据PFK与EPSPS的线性关系，通过检测PFK蛋白的含量判断抗性是否产生，检测结果准确，灵敏度高，特异性好，操作方便，节省成本，从而为研究该蛋白的生物学功能以及检测牛筋草对草甘膦抗药性的产生提供有力工具。附图说明图1为抗草甘膦牛筋草中EPSPS与PFK酶活绝对值比值。图2为目的DNA的PCR扩增电泳图谱结果。图3为原核表达载体菌体PCR检测电泳图。图4为重组蛋白SDS-PAGE电泳图；其中1为0.4mg/mLBSA；2为Marker；3为上清；4为流穿；5为纯化样2倍稀释；6为纯化样5倍稀释。图5为重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图；其中，1为蛋白Marker；2为稀释5倍的纯化蛋白；3为稀释10倍的纯化蛋白。图6为PFK抗原Western检测图片。图7为本专利技术PFK蛋白多克隆抗体灵敏度检测。图8为本专利技术PFK蛋白多克隆抗体检测抗草甘膦牛筋草植株与敏感牛筋草植株蛋白表达电泳图；其中1-2为敏感牛筋草植株；3-7为抗性牛筋草植株。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛筋草PFK蛋白在评价牛筋草对草甘膦抗药性中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.牛筋草PFK蛋白在评价牛筋草对草甘膦抗药性中的应用。


2.检测牛筋草PFK蛋白的试剂或试剂盒在鉴别对草甘膦具有抗性的牛筋草中的应用。


3.一种用于诱导牛筋草PFK蛋白多克隆抗体的抗原多肽，其特征在于，其氨基酸序列为以下：
(1)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或
(2)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。


4.含有权利要求3所述的抗原多肽的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、表达载体或宿主菌。


5.权利要求3所示的抗原多肽或权利要求4所述的生物材料在制备检测牛筋草PFK蛋白或其表达量的试剂或试剂盒中的应用。


6.一种牛筋草PFK蛋白多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体的抗原为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈景超，李香菊，张朝贤，崔海兰，魏守辉，黄红娟，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11