一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法技术

一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，包括以下步骤；(1)预处理及色素测定方法：将培养中的藻液离心后，冷冻干燥后备用。精确称取藻粉分别置于管①和管②，在管①中加乙醇，水浴后离心，取上清液用以测定色素含量，剩余藻沉淀用于下一步测定。管①和管②中分别加入乙醇，水浴后离心脱色，倒掉上清液，重复上述步骤，保留管①和管②底部藻沉淀；(2)破碎方法：取步骤(1)获得的藻沉淀，管①采用碱性加热法、管②采用超声破碎法，破碎完成后，离心，用于下一步测定；(3)测定方法：取管①中的上清液，测定多糖，蛋白质；取管②中的上清液测定脂质，离心去上清，剩余样品用于淀粉含量测定。本发明专利技术具有简单、高效、低成本的特点。

A simple and efficient method for the determination of microalgae biomass composition

【技术实现步骤摘要】
一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法
本专利技术涉及藻类分析研究
，特别涉及一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法。
技术介绍
微藻是广泛存在于地球生态系统中的微生物，他们可以吸收二氧化碳利用光能来进行细胞增殖，通过能量转换和物质平衡，产生叶绿素、蛋白质，脂质，多糖和淀粉等。首先，我们通过研究发现，随着外界环境变化以及营养供给的不同，藻类的细胞生物质组成也会发生明显的变化，从而进一步促进水体富营养化的研究。其次，近年来关于微藻处理高浓度有机生活污水和工业废水的案例也日渐成熟，处理末期的藻类回收利用，并作为可持续绿色能源—生物柴油得到了广泛的关注。最后，藻类的养殖和利用得到了较大的发展，人们开始试图通过人工培养微藻来提取高价值生物衍生物。因此，专利技术一种简单、高效的测定藻类细胞生物质组成的方法十分必要。冷冻干燥法是目前常见的微藻样品处理方法，用于微藻干生物质的制备。可以最大限度的保存各种生物质组分，使样品损失降到最低。冷冻干燥法具有以下特点：(1)可保持样品中的各级营养成分和物质组成，对蛋白质的保存效果较好。(2)在真空和低温下操作，生物的生长和酶作用会受到抑制。(3)脱水较为彻底，干制品重量轻，体积小。(4)真空操作时氧气稀缺，因此一些可氧化物质(如脂质等)受到保护。微藻一般为单细胞球形藻体，细胞壁较为坚韧，通常需采用预处理方式进行破碎，提取代谢产物。目前，常见的藻细胞破碎处理方法有物理破碎法、化学破碎法和溶剂提取法，本方法预实验中采用的超声破碎法属于物理破碎法，碱性破碎法属于化学破碎法，有机溶剂溶解法属于溶剂提取法。超声破碎法可以利用空化现象引起的冲击波和剪切力破碎细胞中细胞壁等结构，使得细胞中各组分游离在溶剂中；碱性破碎法是利用碱性作用使细胞失活，从而使内部成分溶解于溶剂中；而有机溶剂溶解法是利用扩散、润湿浸透等作用将细胞内各组分浸提出来。根据以上不同原理，三种破碎方法对细胞内成分提取有不同的效果，希望探究一种简便、易行、高效地将微藻细胞中有效成分提取出来的方法。目前，用于指示藻类生长的指标过于单一，多数集中在生长过程中藻细胞数量，色素含量以及胞外产酶等的测定。对于制备藻粉生物质中的油脂，多糖，蛋白质和淀粉这类评估微藻生长的重要指标关注甚少。同时，关于藻类提取物组分定量分析的研究都并不完善，现有的传统方法多以单独测定某一种指标为主，提取效率较低，既不全面，也不综合。因此，浓缩并回收微藻细胞，制备藻类生物质，简便且高效测定其组成十分重要。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，具有简单、高效、低成本的特点。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，包括以下步骤；(1)预处理及色素测定方法：将培养中的藻液离心后收获，冷冻干燥后备用，精确称取藻粉分别置于管①和管②，在管①中加乙醇，水浴后离心，取上清液用以测定色素含量，剩余藻沉淀用于下一步测定，管①和管②中分别加入乙醇，水浴后离心脱色，倒掉上清液，重复上述步骤，保留管①和管②底部藻沉淀；(2)破碎方法：取步骤(1)获得的藻沉淀，管①采用碱性加热法、管②采用超声破碎法，破碎完成后，用于下一步测定；(3)测定方法：取管①中的上清液，测定多糖，测定蛋白质；取管②中的上清液测定脂质，离心，倒上清，剩余样品用于淀粉含量测定。所述的步骤(1)中，所述藻粉为(但不限于)普通小球藻、水华鱼腥藻和铜绿微囊藻，可取在不同生长条件下，处于各生长时期的微藻藻液，离心收集藻沉淀，真空冷冻干燥制成。所述的步骤(1)中，称取藻粉以锡舟为载体在精密天平进行，并记录具体数值。所述的步骤(1)中，分别称取①：1-20mg和②：1-20mg藻粉(精确计重，优选10mg以内)，在管①中按照藻粉质量(mg)：95％无水乙醇体积(mL)＝1：2-1：5的比例，在75℃下水浴5-10min，取出后4000-8000r·min-1下离心10-15min，取上清液用以测定色素含量，在管①和管②中分别加入藻粉质量(mg)：乙醇体积(mL)＝1：2-1：5的75％-95％的乙醇，65℃下水浴1-3h，取出后，重复离心步骤，用于藻粉脱色的乙醇浓度优选80％的无水乙醇进行。所述的步骤(2)中碱性加热法具体步骤如下：往预处理完之后的管①藻沉淀中加入藻粉质量(mg)：溶液体积(mL)＝1：1的2MNaOH溶液，沸水浴10-15min分钟，取出冷却至室温，用2MHCl溶液调pH至7.1左右，4000-8000r·min-1下离心10-15min。所述的步骤(2)中超声破碎法具体步骤如下：往预处理完之后的管②藻沉淀中加入5-10mL的超纯水，在冰水浴的环境中用细胞破碎仪破碎，具体参数为破碎15-20min，功率180w，工作2s停2s，4000-8000r·min-1下离心10-15min。所述的步骤(3)取管①中的上清液，0.5mL测定多糖，1mL测定蛋白质；取管②中的上清液1mL测定脂质，4000-8000r·min-1下离心10-15min，倒上清，剩余样品用于淀粉含量测定。所述步骤(3)中测定多糖采用蒽酮比色法，具体步骤如下：取0.5mL管①上清液，在冰水浴环境中，加入2.5mL蒽酮溶液，摇匀后将比色管置于沸水浴中10-15min，取出于冰水浴中冷却，在紫外分光光度计下测定625nm波长处的吸光度。所述的步骤(3)中测定蛋白质采用考马斯蓝比色法，具体步骤如下：取1mL管①上清液，加入5mL考马斯蓝溶液，混合摇匀后静置计时5min，在紫外分光光度计下测定595nm波长处的吸光度。所述的步骤(3)中测定脂质采用尼罗红显色法，具体步骤如下：取1mL管②上清液，加入2mL超纯水，加入0.333mL浓度为100μg·mL-1的尼罗红试剂，放入暗室，15分钟后利用荧光分光光度计测定在二维模式下激发波长为480nm发射波长区间为500nm～700nm之间的荧光值的峰值(其余参数：扫描速度为2400nm·min-1，电压500V，激发发射波长间隔为5nm)。所述的步骤(3)中测定淀粉方法具体步骤如下：取管②中去上清液后的藻沉淀，利用Megazyme试剂盒测定淀粉含量。所述的步骤(3)中用紫外分光光度计测蛋白质时用玻璃比色皿，用荧光分光光度计测脂质时用四面透光的石英比色皿，而其余用紫外分光光度计的方法均用双面石英比色皿。所有方法中加入液体都要沿着内壁缓慢加入，并摇匀完全溶解；而倒出上清液时要保持藻沉淀朝着手心，操作快速并防止晃动。通过一系列预处理和破碎方法后，测定多糖，蛋白，脂质的取样体积，以及加入蒽酮，考马斯蓝和尼罗红溶液的体积与制作标准曲线的参数设计相关，可适当等比例放大或缩小。本专利技术的有益效果：微藻干生物质的制备过程采用可靠的方法，不会对其有效成分进行破坏；采用有效乙醇脱色方法，对藻类色素进行去除，减少对后续测样的干扰；根据不同组分的特征，选用不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，包括以下步骤；/n(1)预处理及色素测定方法：/n将培养中的藻液离心后收获，冷冻干燥后备用，精确称取藻粉分别置于管①和管②，在管①中加乙醇，水浴后离心，取上清液用以测定色素含量，剩余藻沉淀用于下一步测定。管①和管②中分别加入乙醇，水浴后离心脱色，倒掉上清液，重复上述步骤，保留管①和管②底部藻沉淀；/n(2)破碎方法：/n取步骤(1)获得的藻沉淀，管①采用碱性加热法、管②采用超声破碎法，破碎完成后，用于下一步测定；/n(3)测定方法：/n取管①中的上清液，测定多糖，测定蛋白质；取管②中的上清液测定脂质，离心，倒上清，剩余样品用于淀粉含量的测定。/n

【技术特征摘要】
1.一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，包括以下步骤；
(1)预处理及色素测定方法：
将培养中的藻液离心后收获，冷冻干燥后备用，精确称取藻粉分别置于管①和管②，在管①中加乙醇，水浴后离心，取上清液用以测定色素含量，剩余藻沉淀用于下一步测定。管①和管②中分别加入乙醇，水浴后离心脱色，倒掉上清液，重复上述步骤，保留管①和管②底部藻沉淀；
(2)破碎方法：
取步骤(1)获得的藻沉淀，管①采用碱性加热法、管②采用超声破碎法，破碎完成后，用于下一步测定；
(3)测定方法：
取管①中的上清液，测定多糖，测定蛋白质；取管②中的上清液测定脂质，离心，倒上清，剩余样品用于淀粉含量的测定。


2.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，藻粉为(但不限于)普通小球藻、水华鱼腥藻和铜绿微囊藻，选取在不同生长条件下，处于各生长时期的微藻藻液，离心收集藻沉淀，真空冷冻干燥制成。


3.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，分别称取①：1-20mg和②：1-20mg藻粉，在管①中按照藻粉质量(mg)：95％无水乙醇体积(mL)＝1：2-1：5的比例，在75℃下水浴5-10min，取出后4000-8000r·min-1下离心10-15min，取上清液用以测定色素含量，在管①和管②中分别加入藻粉质量(mg)：乙醇体积(mL)＝1：2-1：5的75％-95％的乙醇，65℃下水浴1-3h，取出后，重复离心步骤，用于藻粉脱色的乙醇浓度优选80％的无水乙醇进行。


4.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中碱性加热法具体步骤如下：往预处理完之后的管①藻沉淀中加入藻粉质量(mg)：溶液体积(mL)＝1：1的2MNaOH溶液，，沸水浴10-15min分钟，取出冷却至室温，用2MHCl溶液调pH至7.1，4000-8000r·min-1下离心10-15min。


5.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中超声破碎法具体步骤如下：往预处理完之后的管②藻沉淀中加入5-10mL的超纯水，在冰水浴...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄悦，楼程浩，罗丽，刘欣月，王晓昌，
申请(专利权)人：西安建筑科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61