一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法技术方案

本发明专利技术公开了一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法。所述双系统耦联用反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，管体的内腔包括下部的反应区，以及上部的储存区；所述储存区设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。由于核酸扩增时，仪器对反应管的加热部位只在管体下部的反应区，对上部储存区处设置的储存室内CRISPR检测试剂影响较小，可以在开始时就将核算扩增试剂与CRISPR检测试剂一起加入到反应管内的相应区域，避免了二次开盖，从而减少气溶胶污染和假阳性问题，使整个检测操作过程更简单方便。

A dual system coupling reaction tube and dual system coupling method for nucleic acid amplification combined with CRISPR detection

【技术实现步骤摘要】
一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法
本专利技术涉及生物技术检测
，特别是涉及一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法。
技术介绍
核酸扩增检测技术是开展分子生物学研究的基础，可用于定性、定量地分析和检测微量核酸，其在临床医学、检验医学、分子生物学、基因组学及食品安全等相关的各个领域发挥着重要的作用，是生命科学发展不可或缺的一种重要检验方法。现有核酸扩增技术可根据是否需要温度循环分为两类：第一类为变温扩增体系，包括聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)、连接酶链式反应(ligasechainreaction，LRC)等。其中PCR技术因其特异性强，灵敏度高，价格低廉等优点，是目前应用最为广泛的核酸体外扩增技术。但该技术需要特定的仪器，同时对操作人员以及实验条件有一定的专业要求。第二类为等温扩增体系，包括环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、滚环扩增技术(RollingCircleAmplification，RCA)以及重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)等，该技术无需热循环过程，不需要特殊仪器，但其扩增易产生假阳性。近年来，CRISPR技术的出现带来了一种更简便灵敏的检测方式。其主要原理是利用Cas酶在体系中guideRNA的引导下与目标序列结合后，便会切换为激活状态，高效的切割体系内其它的单链DNA。在体系内加入含有报告基团的单链DNA探针底物后，Cas蛋白识别到靶序列的存在，就会切割单链DNA探针底物从而释放荧光报告基团产生荧光信号。在目前已知的利用CRISPR检测的体系中，由于受到反应温度的影响，CRISPR体系无法在起始时刻就添加到反应体系中，必须等到反应结束后二次开盖再进行后续添加，极易造成严重的气溶胶污染和假阳性问题，并且使得整个检测操作过程变得复杂和繁琐。现有技术中，常用普通PCR管进行上述核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联方法，比如，授权公告号为CN205077049U的技术公开了一种PCR管、PCR管条、PCR管板的密封结构，包括有管体、管盖，管盖靠近底部的周向外表面上分别向外凸设有环形防脱安全凸扣、位于防脱安全凸扣下方的环形密封保险凸扣，防脱安全凸扣和密封保险凸扣分别紧密顶压在管体的管口内侧面上形成密封结构。公开号为CN102534011A的专利技术公开了一种全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法和装置，所述方法是扩增反应结束后，把反应管在不开盖的情况下放入在密闭性的装置内，在该密闭性装置内反应管被破壁，使反应管内扩增产物与密闭装置内预置的检测液反应，然后进行荧光检测，判读结果。所述装置包括PCR管、离心管和一顶针塞，所述PCR管能置于离心管中，所述顶针塞具有能刺破PCR管的穿刺针，离心管具有可密闭的管盖。然而，该技术方案仅仅是用于PCR扩增结束后荧光检测时避免了PCR反应产物以气溶胶的形式扩散到空气中，并不适用于核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联方法。且操作比较复杂，不能自动化操作，PCR管反应完成后再放入离心管中，PCR管经过长时间操作，外表面也容易沾染污染物，造成假阳性。并且，该技术方案中PCR管刺破过程不易控制，很可能在离心管盖子还没盖合之前就已经将PCR管刺破，或者在离心管盖子盖合后还没将PCR管刺破，造成对结果的影响。另外一方面，该技术方案中只能手动进行操作，而无法实现自动化操作。
技术实现思路
本申请针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法。一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，管体的内腔包括下部的反应区，以及上部的储存区；所述储存区设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。优选的，所述储存室为由管体的储存区管壁向外延伸形成的副管，所述储存室底部与储存区之间分隔开而顶部与储存区之间设有作为所述释放机构的缺口，所述副管的口部与管体的口部高度一致，所述盖体一侧延伸形成用于封盖所述副管的副管盖。由于缺口的存在，在核酸扩增反应结束后，等反应管温度降低，可以通过倾斜或倒置的方式使储存室内的CRISPR检测试剂流出，与核酸扩增反应产物混合汇聚到管体内腔下部的反应区中，然后可以进行CRISPR检测反应。优选的，所述储存区处设有一个作为所述储存室的套管，所述管体在储存区处向一侧扩径形成用于设置所述套管的设置区。反应区的直径较小，且呈上大下小的锥形。扩径是指直径扩大，储存区处的管体扩径后，使储存区的直径比反应区上部最大处还大很多，从而有足够空间来放置套管。放置区在竖向投影上不遮挡反应区，这样不影响向反应区中加反应试剂。设置区的底面可以向反应区一侧倾斜，这样不会在设置区聚集液体。更优选的，所述套管与管体内侧壁固定设置，所述套管顶面开口，套管的口部配合设有可去除的套管盖；所述盖体与管体盖合后，套管顶面与所述盖体之间具有间隙；使用时，去除所述套管盖并将所述盖体与管体盖合，套管的口部兼作所述释放机构。套管配套设有可去除的套管盖，可以将CRISPR检测试剂和核酸扩增试剂预装在反应管中，套管盖密封盖合，可以进行运输，使用时，可以去除套管盖，盖上所述盖体后，进行反应，核酸扩增反应完成后，可通过倾斜或倒置方式使套管内的CRISPR检测试剂加入到反应区与核酸扩增反应产物混合。更优选的，所述套管与管体内侧壁之间上下滑动配合，所述管体内侧壁上设有竖向设置的滑槽，所述套管上配合设有滑块；所述盖体上在盖合后对应所述套管的位置设有可向下按压的弹性区，所述释放机构包括设于盖体弹性区、可向下按压所述套管的顶柱，以及设置在所述设置区的底面、用于在所述顶柱向下按压所述套管时刺穿所述套管底面的穿刺针。弹性区可以由盖体的相应区域设计成减薄的波纹状获得。使用时通过向下按压弹性区的顶柱，顶柱抵顶套管的顶面后，使套管下滑，撞上穿刺针后穿刺针刺破套管的底面，使套管内的CRISPR检测试剂流出到反应区。进一步优选的，所述套管可从管体中取出，所述套管的口部配合设有套管盖，套管放入管体中时口部向上。向套管中加CRISPR检测试剂时，可以将套管从管体中取出，加好后盖合套管盖后放入到管体中。进一步优选的，所述套管可从管体中取出，所述套管的口部在加入CRISPR检测试剂后使用密封膜密封，套管放入管体中时口部向下。向套管中加CRISPR检测试剂时，可以将套管从管体中取出，加好后用密封膜密封套管的口部，然后将套管使用密封膜密封的一面向下放入到管体中，这样只要刺破密封膜就能够使套管内的CRISPR检测试剂流出到反应区。密封膜可以使用现有技术中常用的材质，比如可以是使用Parafilm膜。优选的，所述盖体上具有穿过盖体设置且开本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，其特征在于，管体的内腔包括下部的反应区，以及上部的储存区；所述储存区设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，其特征在于，管体的内腔包括下部的反应区，以及上部的储存区；所述储存区设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。


2.如权利要求1所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述储存室为由管体的储存区管壁向外延伸形成的副管，所述储存室底部与储存区之间分隔开而顶部与储存区之间设有作为所述释放机构的缺口，所述副管的口部与管体的口部高度一致，所述盖体一侧延伸形成用于封盖所述副管的副管盖。


3.如权利要求1所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述储存区处设有一个作为所述储存室的套管，所述管体在储存区处向一侧扩径形成用于设置所述套管的设置区。


4.如权利要求3所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述套管与管体内侧壁固定设置，所述套管顶面开口，套管的口部配合设有可去除的套管盖；所述盖体与管体盖合后，套管顶面与所述盖体之间具有间隙；使用时，去除所述套管盖并将所述盖体与管体盖合，套管的口部兼作所述释放机构。


5.如权利要求3所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述套管与管体内侧壁之间上下滑动配合，所述管体内侧壁上设有竖向设置的滑槽，所述套管上配合设有滑块；
所述盖体上在盖合后对应所述套管的位置设有可向下按压的弹性区；
所述释放机构包括设于盖体弹性区、可向下按压所述套管的顶柱，以及设置在所述设置区的底面、用于在所述顶柱向下按压所述套管时刺穿所述套管底面的穿刺针。


6.如权利要求5所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述套管可从管体中取出，所述套管的口部...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆志成，黄俊，骆广进，樊伟东，张徐俞，
申请(专利权)人：杭州奥盛仪器有限公司，浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33