本发明专利技术提供了一种高亮度、高稳定性免洗SNAP‑tag探针及其制备方法和应用，该探针为在萘酰亚胺4，5‑位引入环己二胺刚性环设计合成的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP‑tag探针，其结构式如(1)所示。由于聚集诱导荧光淬灭的效应，探针分子在水中荧光亮度极低，而与SNAP‑tag结合后荧光量子产率可达0.80以上，荧光增强约28倍。因此，该探针能够对活细胞内融合有SNAP‑tag的目标蛋白进行特异性标记并实现免洗荧光成像。此外，由于稳定性及亮度的提升，该探针实现了超分辨荧光成像(SIM/STED)，分辨率达到120nm。
A high brightness and high stability washless snap tag probe and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及应用
本专利技术属于荧光探针领域，具体涉及一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法和应用。
技术介绍
SNAP-tag标签法已经成为目前应用最为广泛的蛋白质标记技术，通过其与目标蛋白的融合可以对目标蛋白进行示踪、功能的监测等。因此借助有机小分子染料的合理设计可以实现对目标蛋白的多色荧光标记，在单分子检测及超分辨荧光成像领域对蛋白进行实时监测。这也就要求基于小分子的SNAP-tag荧光探针拥有高稳定性的同时在结合SNAP-tag之后有高的荧光增强倍数，以实现精准成像、高信噪比。而目前的商业SNAP-tag探针通常连接有罗丹明、花菁染料，与SNAP-tag结合后荧光增强倍数只有1-2倍。此外，罗丹明与花菁染料的正电性导致此类探针极容易在线粒体聚集，很大程度上增加了荧光成像的背景。因此，科研工作者将环境敏感型荧光染料与苄基鸟嘌呤结合设计合成了诸多荧光增强型SNAP-tag探针。这类探针通过在水环境荧光量子产率低，非极性环境中荧光量子产率高的特点达到荧光增强的目的。然而，通常从水环境到SNAP-tag疏水空腔中荧光伴有大幅的蓝移。在细胞复杂的环境中很难采用合适的波段捕捉荧光信号，从而导致荧光信号的误差。如何通过环境不敏感型荧光染料的合理设计达到与SNAP-tag结合后高荧光增强倍数的同时实现信号采集的准确性是目前SNAP-tag探针设计及应用的屏障。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，该探针与SNAP-tag蛋白结合后荧光强度增加28倍，可实现活细胞内的免洗荧光成像。本专利技术提供一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的制备方法，该方法步骤简单、易于提纯等优点。本专利技术提供一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，通过萘酰亚胺4,5-位环己二胺的引入达到荧光稳定性、亮度得到大幅度提升，实现了SNAP-tag蛋白的免洗超分辨荧光成像。此外，萘酰亚胺变为环境不敏感型荧光染料，在与SNAP-tag结合前后荧光峰型及波长不随微环境变化而发生变化，保持了荧光信号的准确性。一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，该荧光探针具有如下结构：一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，此荧光探针合成路线如下：具体合成步骤如下：(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)；(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺；(3)SNAP-tag探针的合成将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针。步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：4-氨甲基苄醇的质量比为1:0.5-2；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL；步骤(2)中：N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与环己二胺的质量比为1:1-3；N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-200g/mL。步骤(3)中：N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-5:1-5；N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:50-200g/mL。上述一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针对SNAP-tag蛋白具有高度选择性，能够在活细胞等复杂环境中对SNAP-tag进行特异性识别。一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在细胞、组织及活体内的荧光成像领域的应用。一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针用于SNAP-tag蛋白的识别与检测。一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在单分子检测中的应用。一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。本专利技术具有以下特征：本专利技术的SNAP-tag探针拥有合成原料低价、方法简单通用等优点。该SNAP-tag探针在结合SNAP-tag蛋白后，荧光逐渐恢复，达到较好off-on的效果，荧光增强倍数可达28倍。该SNAP-tag探针分子在结合SNAP-tag蛋白后荧光量子产率均大于0.80，亮度高、光稳定性好。该SNAP-tag探针在结合SNAP-tag蛋白后荧光波长及峰型不随极性变化而改变，能够保持荧光信号的准确性。该SNAP-tag探针能够对活细胞内SNAP-tag蛋白进行特异性识别，并实现免洗荧光成像。此外，探针可用于SIM，STED等超分辨荧光成像。附图说明图1实施例1制备的SNAP-DAC的核磁谱图氢谱。图2实施例1制备的探针BA-DAC在不同溶剂中归一化的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。图3实施例1制备的探针SNAP-DAC在PBS中与1μMSNAP-tag蛋白结合前后荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM。图4实施例1制备的探针SNAP-DAC在PBS中与1μMSNAP-tag蛋白结合的动力学曲线图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM。图5实施例1制备的探针SNAP-DAC在转染的pSNAPf-Cox8A的HEK293细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。图6实施例1制备的探针SNAP-DAC在转染的pSNAPf-H2B的HEK293细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。图7实施例1制备的探针SNAP-DAC在转染的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，其特征在于该探针的结构如下：/n
【技术特征摘要】
1.一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，其特征在于该探针的结构如下：
2.根据权利要求1所述的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征按照如下步骤进行：
(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)；
(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺；
(3)SNAP-tag探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针。
3.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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