一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针制造技术

本发明专利技术提供了一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针，一类可用于细胞核荧光成像的萘酰亚胺类探针，该荧光探针具有合成原料低廉、方法简单且易于衍生等优点。研究发现，该探针在萘酰亚胺母体的4‑,5‑位引入的环己二胺结构使分子有很强的刚性，可以有效地抑制非辐射跃迁过程，此类染料在乙醇中的摩尔消光系数达到46443M

A kind of nuclear fluorescence probe with high brightness, high light stability and environment insensitivity

【技术实现步骤摘要】
一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针
本专利技术属于荧光成像
，具体涉及一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针。
技术介绍
由于细胞核在遗传物质转录的重要性，细胞核的标记在生物学以及多种病理研究中至关重要。随着对细胞核的研究的不断深入，研究者们对细胞核荧光染料的性质与功能要求也不断提高，尤其超分辨荧光成像技术的迅速崛起促使新型的高稳定性、高亮度细胞核荧光染料的开发与应用。目前常用的细胞核荧光染料包括有：(1)SYTO/POPO系列等(基于花菁染料)，此类标记试剂能够插入DNA双链，可用可见光激发，荧光亮度高；但是此类荧光标记染料带有正电荷，无法精准标记细胞核，光稳定极差。(2)最为普遍的细胞核染料DAPI、Hoechst系列激发波长为紫外光360nm，对细胞损害大，最合适激发光无法与荧光成像技术的激光匹配(通常最短波长为405nm激光器)。此外，此类细胞核染料荧光发射光谱宽(容易发生串色)，细胞透膜性差，染色时间长(通常30分钟以上)，在活细胞染色实验中受到严格限制。以上细胞核荧光染料均很难满足超分辨技术对荧光稳定性、荧光亮度、长时间染色等性能的需求，因而开发高亮度、高稳定性、能快速标记细胞核的荧光染料迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术开提供了一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针，一类萘酰亚胺类荧光探针，该探针在萘酰亚胺母体的4-,5-位引入环己二胺结构，同时增加了染料的刚性和平面性；引入碱性的吗啉环作为细胞核靶向基团。研究发现这类染料有很高的亮度、优异的光稳定性，能够快速透过细胞并高选择性地标记于细胞核中，可进一步用于荧光成像。该染料还具有环境不敏感性，在不同环境中的光谱性质差异极小，有很好的成像准确性。本专利技术一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针，其结构式如下所示：一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针的合成方法，合成步骤如下：具体合成步骤如下：步骤一：中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(Lyso-NBr)的合成将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于10-40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉，升温至50-70℃下反应1-10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺。步骤二：细胞核探针Nu-DAC的合成将中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺，将反应液缓慢加热至60-90℃，并反应10-24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物得到细胞核探针Nu-DAC。步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与N-(2-胺乙基)吗啉的质量比为1:0.3-6，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与乙醇的质量与体积比为1:5-80g/mL。步骤二中，N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与1,2-环己二胺的质量比为1:0.3-30，N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:5-200g/mL。上述细胞核荧光探针在活细胞及活体内能够对细胞核进行特异性标记并实现荧光成像。一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。本专利技术具有以下特征：该探针拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。该探针在萘酰亚胺母体的4-,5-位引入的环己二胺结构使分子有很强的刚性，可以有效地抑制非辐射跃迁过程，此类染料在乙醇中的摩尔消光系数达到46443M-1cm-1，量子产率达到0.73，有很高的亮度和光稳定性。该探针结构有很强的刚性，有明显的共振型染料环境不敏感的特性。该探针有很好的刚性和平面性，可以插入细胞核中的核酸链中，且该探针有合适的脂溶性，能够快速透过细胞膜，因而可以实现对细胞核快速、精准的定位，可应用于细胞核与其他细胞器相互作用研究、细胞凋亡等研究中。附图说明图1为实施例1中制备的细胞核探针Nu-DAC的核磁氢谱；图2为实施例1中制备的细胞核探针Nu-DAC的高分辨质谱；图3为实施例1制备的细胞核探针Nu-DAC在乙醇中归一化荧光激发与发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度与吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；图4为实施例1制备的细胞核探针Nu-DAC与商业染料荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中，经过不同时间激光照射后后其最大荧光发射强度的变化，横坐标为激光照射时间，纵坐标为相对荧光强度，即最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值；图5为实施例1中制备的细胞核染料Nu-DAC在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化紫外吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；图6为实施例1中制备的细胞核染料Nu-DAC在不同溶剂中的归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光发射强度，荧光探针的浓度为10μM；图7为实施例1制备的细胞核染料Nu-DAC在不同细胞系中(CHO中国仓鼠卵巢细胞、HT29人结肠癌细胞、HeLa宫颈癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞、C3A人肝癌细胞、PC3前列腺癌细胞)荧光成像图；图8为实施例1制备的细胞核染料Nu-DAC与商业细胞核荧光染料(Hoechst33342)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中实时染色成像图。具体实施方式实施例1细胞核染料Nu-DAC的合成方法。中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(Lyso-NBr)的合成：将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉(609mg，4.68mmol)，升温至70℃下反应3h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝80/1，V/V)分离得Lyso-NBr，为土黄色固体0.12g，产率55％。其核磁谱图氢谱数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.33(t,J＝6.6Hz,2H),3.71–3.57(m,4H),2.70(t,J＝6.5Hz,2H),2.57(s,4H).其核磁谱图碳谱数据如下：13CNMR(101MHz,CDCl3)δ162.85,162.08,151.34,136.00,132.36,131.25,130.63,125.73,124.22,123.57,122.44,121.29,67.02,55.94,53.81,37.66.其高分辨质谱数据如下：HRMS(ESI)：m/z：[M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示，/n

【技术特征摘要】
1.一种高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示，





2.如权利要求1所述的高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针的合成方法，其特征在于：该合成的具体方法如下：
步骤一：中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于10-40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉，升温至50-70℃下反应1-10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺；
步骤二：细胞核探针Nu-DAC的合成
将中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺，将反应液缓慢加热至60-90℃，并反应10-24h。减压除去乙二醇甲醚，残余...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21