利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法技术

本发明专利技术公开了一种利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法，所述方法，包括如下步骤：(一)LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆；所涉及的引物包括：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8；(二)LcE3W251L/F309L菊酯降解酶的表达；(三)分离和纯化表达的LcE3W251L/F309L菊酯降解酶。本发明专利技术批量生产具有极高生物活性的羧酸脂酶突变体，从而通过该生物活性物质，有效水解土壤和水质中的菊酯类农药成分，净化生态环境，维护动植物和谐共处的稳态。

Primers and methods for the preparation of pesticide degrading enzymes by genetic engineering

【技术实现步骤摘要】
利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法
本专利技术涉及一种农药降解酶的制备方法，具体涉及菊酯类农药降解酶(LcE3W251L/F309L)的方法。
技术介绍
有机磷农药常被用作杀虫剂喷洒在果树、蔬菜上，是有机氯农药的取代物，其药效高，品种多，防治范围广，成本低，为增加生产、防治传播疾病做出了巨大贡献。但有机磷农药是一种神经毒物，对生物体内的胆碱酯酶有抑制作用，抑制胆碱酯酶使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱堆积，引起神经功能紊乱，从而导致肌体的损害。在人们生活质量不断提高的同时，有机磷农药在果蔬上残留对人体健康的影响和引起的相关安全隐患问题逐渐引起人们的关注。目前，有机磷农药污染降解方法主要有超声波、吸附、洗涤和电离辐射等物理方法；水解、氧化分解和光化学降解等化学方法；微生物、降解酶和工程菌等生物方法。其中生物降解方法是利用生物作用将农药分解为小分子无毒或低毒化合物，最终降解为水。与物理和化学降解技术相比，具有更加高效、彻底、无二次污染等优势。有研究报道，双翅目昆虫铜绿蝇(Luciliacuprina,Lc)是一类抗有机磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：/n一组用于扩增野生型LcE3基因序列的引物基因序列，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。/n

【技术特征摘要】
1.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：
一组用于扩增野生型LcE3基因序列的引物基因序列，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。


2.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：一组用于在野生型LcE3序列中引入W251L突变的引物基因序列，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。


3.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：一组用于在LcE3W251L突变体序列中引入F309L突变的引物基因序列，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。


4.利用基因工程制备农药降解酶方法，其特征在于，包括如下步骤：
(一)LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆；
所涉及的引物包括：
一组用于扩增野生型LcE3基因序列的引物基因序列，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；
一组用于在野生型LcE3序列中引入W251L突变的引物基因序列，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；
一组用于在LcE3W251L突变体序列中引入F309L突变的引物基因序列，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；
(二)LcE3W251L/F309L菊酯降解酶的表达；
(三)分离和纯化表达的LcE3W251L/F309L菊酯降解酶。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆，包括如下步骤：
(1)合成大肠杆菌密码子优化后的LcE3的基因片段；
(2)以上述经优化的野生型LcE3的片段为模板，以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的序列为引物，扩增野生型LcE3基因；
SEQIDNO:3F-LcE3-NdeI-primer:5’
-tacatATGAACTTCAACGTTTCTCT-3’
SEQIDNO:4R-LcE3-XhoI-primer:5’
-tgctcgagGAACAGGTCACGGTGTTTTT-3’；
回收PCR产物，并利用内切酶对回收产物以及所选质粒载体，在上述插入位点进行双酶切；
(3)使用经筛选出的连接酶，将上述PCR产物片段连接到所述的载体中；
(4)摇菌验证目的基因已准确插入载体,且在PCR过程中未引入突变，最终完成野生型LcE3的表达质粒的克隆；
(5)定点突变W251L位点:以步骤(4)获得的野生型LcE3质粒为模板，以SEQIDNO:5所示的基因序列和SEQIDNO:6所示的基因序列为引物，进行定点突变，并扩增突变序列；
SEQIDNO:5F-LcE3W251L:5’
-TGCCCGctgGCGAACACCCAGTGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晗，张佳元，谢知芳，李航，
申请(专利权)人：上海鲜锐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31