一种黄芪愈伤组织诱导的培养方法及其应用技术

本发明专利技术涉及黄芪愈伤组织诱导的培养方法及其应用，选用黄芪种子萌发制备无菌黄芪苗，然后用无菌黄芪苗进行后续的愈伤组织培养，无需另外消毒，因为不受消毒剂的影响，所产生的愈伤组织活力强，可长期继代；同时，黄芪无菌苗的茎、叶片、子叶和胚轴进行诱导培养，均可以获得90％以上的诱导率；在黄芪愈伤组织诱导培养基中施加活性炭和中药提取液，能够明显提高诱导率，并通过愈伤组织中黄芪甲苷的含量。所述方法具有诱导率高，愈伤组织生长旺盛，增殖速度快，培养周期短，黄芪甲苷含量高，操作简单，并能有效阻止褐化的优点。

A culture method of Astragalus membranaceus callus induction and its application

【技术实现步骤摘要】
一种黄芪愈伤组织诱导的培养方法及其应用
本专利技术涉及植物组织培养
，特别涉及一种黄芪愈伤组织诱导的培养方法及其应用。
技术介绍
黄芪属于豆科多年生草本植物，以根入药，迄今已有2000多年的历史。黄芪的主要药理作用有补气固表、利尿、托毒排脓、生肌等疗效，主治气短、虚脱、心悸、自汗、体虚浮肿、慢性肾炎、脱水、久泻、气虚、气血不足、中气下陷，有抗菌消炎、降压利尿、解毒利胆等功效，是一种常用中草药。随着人们日益增长的保健观念的强化，黄芪的需求量将会逐年增加，但目前黄芪的野生资源逐年减少，栽培品种下降且面临农药污染和重金属残留等问题的困扰。因此应用现代生物技术提高黄芪的产量，改善其品质，探索工业化生产的可行途径对黄芪的生产具有重要意义，黄芪甲苷是中国药典规定的含测指标，如果能寻找到提高黄芪甲苷含量的人工黄芪产品，将具有良好的开发和应用前景。数年来，我国科技工作者在黄芪育苗繁殖技术方面做了大量的富有成效的工作，为黄芪良种化栽培奠定了基础。然而，黄芪繁殖采用直播和育苗技术，由于黄芪种子具有硬实性导致存在种子繁殖出苗率低，育苗移栽繁殖周期长，苗木繁殖系数低等问题。为了解决这一问题，采用组织培养方法，不仅可以缩短人工栽培黄芪周期，而且可大量繁殖黄芪幼苗，从而实现黄芪种苗规模化生产。目前，关于黄芪的组织培养研究报道较多，但是关于用无菌苗进行黄芪离体快速繁殖，、抑制组织培养过程中的褐化问题，以及如何提高组织培养的黄芪中黄芪甲苷的含量等方面的研究比较少。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有技术的不足，提供一种黄芪愈伤组织的培养方法及其应用，所述方法具有诱导率高，愈伤组织生长旺盛，增殖速度快，培养周期短，黄芪甲苷含量高，操作简单，并能有效阻止褐化的优点。本专利技术为了解决上述问题，采用的技术方案是：提供一种黄芪愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：步骤1.黄芪无菌苗的制备将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入75％乙醇中浸泡1-3min，用无菌水冲洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗5-10遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25-30℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗；步骤2.愈伤组织的诱导培养将步骤1的黄芪无菌苗切成0.5～1.0cm长的小段接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养10～20d，所述愈伤组织诱导培养基MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度0.5～1.0mg/L、萘乙酸NAA质量浓度0.2～0.6mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～10g/L，活性炭的质量浓度1-3mg/L，中药提取液10-20g/L，pH为5.8-6.2；步骤3.愈伤组织的快速培养将步骤2的愈伤组织转移至增殖培养基中培养10-15d，间隔5d更换增殖培养基；所述增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2～3.5mg/L、萘乙酸NAA质量浓度1～3.0mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～8g/L，pH值调节为5.8～6.2。进一步，所述步骤2中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一种或几种，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.6～0.8g/L、抗坏血酸Vc质量浓度0.1～0.3g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP质量浓度4.0～6.0g/L。进一步，所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子，或膜荚黄芪种子的一种；进一步，所述步骤2中选择黄芪无菌苗的茎、叶片、子叶和胚轴进行诱导培养；进一步，所述MS培养基的每升的组成如下：大量元素：KNO34-6mM，Ca(NO3)2·4H2O4-6mM，MgSO4·7H2O1.5-2.5mM，KH2PO40.8-1.2mM，微量元素：H3BO344-48μM，MnCl2·4H2O8-10μM，ZnSO4·7H2O0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na40-60μM；有机物质：肌醇80-100μM，蔗糖100-150μM，水解酪蛋白300-500μM；进一步，所述步骤2中的中药提取液的制备方法为：按照重量配比5:2:1:1取黄芪、人参、茯苓、罗汉果，加入3-5倍水进行煎煮，过滤后将滤液冻干为粉；精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。进一步，所述活性炭的粒径为200-400nm。进一步，本专利技术的技术方案还包括黄芪愈伤组织的应用，优选提取黄芪愈伤组织中的黄芪甲苷。其中，所述提取黄芪愈伤组织中黄芪甲苷的方法可以是本领域中的常规提取方法。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术选择由黄芪种子萌发制备无菌黄芪苗，然后用无菌黄芪苗进行后续的愈伤组织培养，无需另外消毒，因为不受消毒剂的影响，所产生的愈伤组织活力强，可长期继代；(2)本专利技术选择黄芪无菌苗的茎、叶片、子叶和胚轴进行诱导培养，均可以获得90％以上的诱导率，同时，在愈伤组织诱导培养基中添加抗氧剂能有效抑制愈伤组织的褐化问题。(3)本专利技术在黄芪愈伤组织诱导培养基中施加活性炭和中药提取液，能够明显提高诱导率，并通过愈伤组织中黄芪甲苷的含量。(4)本专利技术提供的黄芪愈伤组织的培养方法具有诱导率高，愈伤组织生长旺盛，增殖速度快，培养周期短，黄芪甲苷含量高，操作简单，并能有效阻止褐化的优点。附图说明图1是本专利技术黄芪无菌苗茎切块愈伤组织的生长图图2是本专利技术黄芪无菌苗叶片切块愈伤组织的生长图图3是本专利技术黄芪无菌胚轴切块愈伤组织的生长图具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。制备MS培养基，所述MS培养基每升的组成如下：大量元素：KNO34-6mM，Ca(NO3)2·4H2O4-6mM，MgSO4·7H2O1.5-2.5mM，KH2PO40.8-1.2mM，微量元素：H3BO344-48μM，MnCl2·4H2O8-10μM，ZnSO4·7H2O0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na40-60μM；有机物质：肌醇80-100μM，蔗糖100-150μM，水解酪蛋白300-500μM。制备中药提取液的方法如下：按照重量配比5:2:1:1取黄芪、人参、茯苓、罗汉果，加入3-5倍水进行煎煮，过滤后将滤液冻干为粉；精确称取100mg冻干粉，加入1mLPBS并置于80℃助溶，8000r/min离心10min，取上清液过滤，分装并-20℃保存。不同培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄芪愈伤组织的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1.黄芪无菌苗的制备/n将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入75％乙醇中浸泡1-3min，用无菌水冲洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗5-10遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25-30℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗；/n步骤2.愈伤组织的诱导培养/n将步骤1的黄芪无菌苗切成0.5～1.0cm长的小段接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养10～20d，/n所述愈伤组织诱导培养基MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度0.5～1.0mg/L、萘乙酸NAA质量浓度0.2～0.6mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～10g/L，活性炭的质量浓度1-3mg/L，中药提取液10-20g/L，pH为5.8-6.2；/n步骤3.愈伤组织的快速培养/n将步骤2的愈伤组织转移至增殖培养基中培养10-15d，间隔5d更换增殖培养基；所述增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2～3.5mg/L、萘乙酸NAA质量浓度1～3.0mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～8g/L，pH值调节为5.8～6.2。/n...

【技术特征摘要】
1.一种黄芪愈伤组织的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1.黄芪无菌苗的制备
将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入75％乙醇中浸泡1-3min，用无菌水冲洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗5-10遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25-30℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗；
步骤2.愈伤组织的诱导培养
将步骤1的黄芪无菌苗切成0.5～1.0cm长的小段接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养10～20d，
所述愈伤组织诱导培养基MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度0.5～1.0mg/L、萘乙酸NAA质量浓度0.2～0.6mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～10g/L，活性炭的质量浓度1-3mg/L，中药提取液10-20g/L，pH为5.8-6.2；
步骤3.愈伤组织的快速培养
将步骤2的愈伤组织转移至增殖培养基中培养10-15d，间隔5d更换增殖培养基；所述增殖培养基为MS培养基、6-苄胺基嘌呤6-BA质量浓度2～3.5mg/L、萘乙酸NAA质量浓度1～3.0mg/L、蔗糖质量浓度15～45g/L、琼脂质量浓度4～8g/L，pH值调节为5.8～6.2。


2.根据权利要求1所述的一种黄芪愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子，或膜荚黄芪种子的一种。


3.根据权利要求1所述的一种黄芪愈伤组织的培养方法，其特征在于：所述步骤2中愈伤组织诱导培养基内加入抗氧化剂柠檬酸、抗坏血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一种或几种，抗氧化剂柠檬酸质量浓度0.6～0.8g/L、抗坏血酸Vc...

【专利技术属性】
技术研发人员：白朕卿，张秀娟，随洋，吴佳文，田雨，高新新，焦巍，陈启渊，
申请(专利权)人：内蒙古自治区生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：内蒙;15