一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法技术

本发明专利技术一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，设计构思是基于机器学习中聚类分析算法，结合培养时间(或OD

【技术实现步骤摘要】
一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法
本专利技术涉及一种单细胞生长检测方法，尤其是一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法。
技术介绍
微生物生长分为不同的阶段：滞后期(为细胞分裂做准备)，对数期(以细胞加倍为特征)、稳定期(细胞生长速率和凋亡速率相等)和死亡期(细胞死亡)四个生长周期；在一个封闭的环境中，由于细胞的生长，所需的营养液被消耗殆尽，细胞的群体呈现了生长曲线的各个时期，不同的生长阶段具有不同的生化反应，以合成细胞生长和分裂所必须的细胞成分；准确识别微生物的生长时期，对于实时监测食品发酵、生物制药等工程菌的代谢状态，判断反应终点具有重要意义；现有技术中，对微生物生长时期的检测方法主要基于群体细胞水平，这种群体细胞检测方法(如光密度、标准平板计数等)存在耗时、操作繁琐、需要样品量大、不适用于连续监测等问题；而且，现有方法也不能描述单个微生物细胞在生长过程中胞内物质(如DNA、蛋白质、脂质等)相对含量所发生的变化；如何快速、灵敏的从本质上检测微生物单细胞在生长过程中所发生的生化变化，是单细胞生长研究的重要难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，该方法能快速、灵敏且无需标记的检测微生物单细胞生长，解决了现有技术存在耗时、操作繁琐、劳动力昂贵和试剂敏感等问题，操作简单，适合推广。一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，包括如下步骤：步骤一、在实验室中，将微生物培养在最适其培养的条件下，并培养至不同生长时期；作为一种举例说明，所述微生物包括但不限于：细菌、真菌、藻类；步骤二、利用现有生长曲线检测方法检测微生物生长时期；测量培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物细胞密度，即OD600；作为一种举例说明，所述现有生长曲线检测方法：包括但不限于光密度、比浊法、标准平板计数法等；步骤三、采集不同生长时期的微生物单细胞拉曼光谱；应用拉曼光谱仪，选择调整光谱仪参数，探索最佳参数设置，采集所有单细胞拉曼光谱数据；作为一种举例说明，分别采集培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物单细胞拉曼光谱，每个时间段采集50组拉曼数据，六个时间段共计300组；步骤四、对微生物单细胞拉曼光谱进行标准化处理，包括如下具体操作：步骤4.1，对微生物单细胞拉曼光谱去除宇宙射线；基于差分法，首先计算微生物单细胞拉曼光谱各波数峰强差分，设置宇宙射线判别阈值，若某点差分大于该阈值，可确定该波数峰为宇宙射线并选取前后点坐标值抹平该宇宙射线，公式可表示为：式中，为某波数的差分值，(ymax-ymin)/Δ为宇宙射线判别阈值，Δ为设置窗口宽度，Yi为某波数峰强值，Yi-1、Yi+1为其波数前、后波数峰强值；作为一种举例说明，所述设置窗口宽度可设置为2-5个波数；步骤4.2，应用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法或滑动小波变换对微生物单细胞拉曼光谱进行基线校正；步骤4.3，对微生物单细胞拉曼光谱进行自适应平滑滤波，设置信噪比阈值，若拉曼光谱信噪比小于所述信噪比阈值，应用Savitzky-Golay卷积平滑算法进行一次平滑处理，再次计算平滑后信噪比，直到信噪比大于所述信噪比阈值；信噪比计算方法公式：其中，Ymax和Ymin为全谱段最大最下强度值，ymax和ymin为静默区最大最小强度值；作为一种举例说明，所述snr为：10-20；步骤4.4，将所述微生物单细胞拉曼光谱进行无量纲化处理；步骤五、确定不同培养时间的微生物单细胞所属生长时期，用聚类算法将步骤四中处理后的微生物单细胞拉曼光谱聚成四个簇，分别对应生长周期的四个时期，统计每个簇中包含各培养时间的单细胞分布情况，将6个培养时间段映射到4个生长时期，分析四个生长时期单细胞培养时间的数据分布，设定比例阈值，若某簇中对应培养时间单细胞数量占比大于该比例阈值，可用该培养时间映射的生长时期表示该簇；如果对应培养时间单细胞数量的最大占比小于所述比例阈值，根据OD600值，重新训练聚类算法，调整簇划分；作为一种举例说明，所述聚类算法采用层次聚类算法，即HCA；步骤六、求各生长时期微生物单细胞拉曼光谱均谱，确定所求物质峰位、峰宽，并求峰面积；具体操作包括：步骤6.1，根据步骤五，将簇中占比最大的培养时间所有单细胞求均谱；步骤6.2，确定标准峰位；作为一种举例说明，选择波数参照文献：744.3-770.2、825.9-861.2、1003-1042中记载的数据，作为蛋白质峰区间；作为一种举例说明，选择波数参照文献：633.5-674中记载的数据，作为核酸峰区间；步骤6.3，峰面积计算过程具体包括：6.3.1,用于修正实验中拉曼光谱峰位偏移，利用小波变换求一维阵列的峰位，通过对每个宽度的小波进行卷积来平滑向量，在足够长的尺度上出现的具有足够高信噪比的相对最大值被接受，标记波数和强度，为了消除光谱边缘效应，去除寻峰结果中首尾谱峰；6.3.2,基于滑动平滑窗口对峰位进行二次校正，修正不同仪器所测拉曼光谱精确峰位；6.3.3,特征物质含量计算，Xi→Ti其中，Xi表示波数值，Ti表示波数对应序列，S表示选定峰面积，表示胞内物质含量，t1和t2表示峰波数的起止位置；步骤七、不同生长阶段单细胞胞内物质变化可视化分析；作为一种举例说明，所述可视化分析包括但不限于蛋白、核酸峰面积随生长时间变化的柱状图，蛋白与核酸比率变化柱状图等。本专利技术的有益效果：拉曼光谱具有提供生物分子化学组成信息的优势,单细胞拉曼光谱是胞内所有物质的拉曼光谱总和，不同物质分布在不同的峰位，某峰面积可表示细胞内某种物质含量，可以通过聚类算法确定微生物单细胞生长时期，可以通过分析不同生长时期某处峰面积变化来反应胞内某种物质变化；引入拉曼光谱技术，对单细胞拉曼光谱优化处理，用于检测细胞生长过程胞内物质变化，实现从本质上检测微生物单细胞胞内物质含量随生长状态变化；具有快速、灵敏且无需标记的优势，跳过了现有技术存在耗时、操作繁琐、劳动力昂贵和试剂敏感等问题。附图说明图1是本专利技术一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之不同培养时间单细胞拉曼光谱层次聚类(HCA)结果示意图图2是本专利技术一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之统计聚类分析中各生长时期数据分布示意图图3是本专利技术一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之各生长时期单细胞拉曼光谱均谱示意图图4是本专利技术一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之单细胞生长过程胞内物质变化可视化分析的蛋白和核酸生长变化示意图图5是本专利技术一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法之单细胞生长过程胞内物质变化可视化分析的蛋白核酸比例示意图图6是本专利技术一种基于拉曼光谱的微本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一、在实验室中，将微生物培养在最适其培养的条件下，并培养至不同生长时期；/n步骤二、利用现有生长曲线检测方法检测微生物生长时期；测量培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物细胞密度，即OD

【技术特征摘要】
1.一种基于拉曼光谱的微生物单细胞生长检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、在实验室中，将微生物培养在最适其培养的条件下，并培养至不同生长时期；
步骤二、利用现有生长曲线检测方法检测微生物生长时期；测量培养时间为1h、2h、3h、4h、6h、14h的微生物细胞密度，即OD600；
步骤三、采集不同生长时期的微生物单细胞拉曼光谱；应用拉曼光谱仪，选择调整光谱仪参数，探索最佳参数设置，采集所有单细胞拉曼光谱数据；
步骤四、对微生物单细胞拉曼光谱进行标准化处理，包括如下具体操作：
步骤4.1，对微生物单细胞拉曼光谱去除宇宙射线；
基于差分法，首先计算微生物单细胞拉曼光谱各波数峰强差分，设置宇宙射线判别阈值，若某点差分大于该阈值，可确定该波数峰为宇宙射线并选取前后点坐标值抹平该宇宙射线，公式可表示为：



式中，为某波数的差分值，(ymax-ymin)/Δ为宇宙射线判别阈值，Δ为设置窗口宽度，Yi为某波数峰强值，Yi-1、Yi+1为其波数前、后波数峰强值；
步骤4.2，应用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法或滑动小波变换对微生物单细胞拉曼光谱进行基线校正；
步骤4.3，对微生物单细胞拉曼光谱进行自适应平滑滤波，设置信噪比阈值，若拉曼光谱信噪比小于所述信噪比阈值，应用Savitzky-Golay卷积平滑算法进行一次平滑处理，再次计算平滑后信噪比，直到信噪比大于所述信噪比阈值；
信噪比计算方法公式：
其中，Ymax和Ymin为全谱段最大最下强度值，ymax和ymin为静默区最大最小强度值；
步骤4.4，将微生物单细胞拉曼光谱进行无量纲化处理；
步骤五、确定不同培养时间的微生物单细胞所属生长时期，用聚类算法将微生物单细胞拉曼光谱聚成4个簇，分别对应生长周期的4个时期，统计每个簇中包含各培养时间的单细胞分布情况，将6个各培养时间段映射到4个生长时期，分析4个生长时期单细胞培养时间的数据分布，设定比例阈值，若某簇中对应培养时间单细胞数量占比大于该比例阈值，可用该培养时间映射的生长时期表示该簇；如果对应培养时间单细胞数量的最大占比小于所述比例阈值，根据OD600值，重新训练聚类算法，调整簇划分；
步骤六、求各生长时期微生物单细胞拉曼光谱均谱，确定所求物质峰位、峰宽，并求峰面积；具体操作包括：
步骤6.1，根据步骤五，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文杰，李新立，薛莹，李航，王楠，
申请(专利权)人：长春长光辰英生物科学仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22