菌种ZFM54的获取方法技术

本发明专利技术公开一种菌种ZFM54的获取方法，其包括：(A)从婴儿粪便中分离乳酸菌；(B)菌种的活化和保藏；(C)指示菌的培养；(D)乳酸菌初筛；(E)产细菌素乳酸菌复筛；以及(F)菌种鉴定，菌种ZFM54能够作为天然食品防腐剂和抗生素替代品。

Acquisition method of strain zfm54

【技术实现步骤摘要】
菌种ZFM54的获取方法
本专利技术涉及菌种培养、筛选领域，更进一步，涉及一菌种ZFM54的获取方法。
技术介绍
微生物和食源性致病菌的污染是导致食品腐败和食物中毒的主要原因，目前食品工业中最常用的预防和控制微生物污染的方法就是向其中添加化学防腐剂。但是化学防腐剂如果使用不当会有一定的副作用，对人体健康造成危害。加之新世纪以来，由于抗生素的滥用，动物源食品中的药物残留成为人类健康的一大严重威胁，引起人体过敏反应和体内菌群失衡，从而导致腹泻、维生素缺乏等。而且随之产生的细菌抗生素耐药性问题也对公众健康和畜牧生产有着非常重要的影响。因此，寻找安全、绿色、无毒的化学防腐剂替代品，解决抗生素耐药性问题成为世界趋势。益生菌(Probiotics)又称微生态调节剂、生态制品、活菌制剂等，是指一类通过添加到食品或饲料中能够起到调节肠道微生态，从而对人或动物产生有利影响的微生物。益生菌的概念最早源于希腊语，意为“对生命有益”。2001年，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合专家组对益生菌做出如下定义：通过摄取适当的量、对食用者的身体健康能发挥有效作用的活菌。益生菌在自然界、人和动物体内的存在十分广泛，主要包括双歧杆菌类、乳杆菌类、革兰氏阳性球菌类和真菌类。目前，对主要来源于动物体内的一些双歧杆菌、乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、非致病性的链球菌、肠球菌、放线菌和酵母菌等的研究较为广泛。益生菌具有调节肠道菌群结构，改善肠道健康，促进营养元素的消化吸收，抑制致病微生物的生长和调节免疫应答的作用。随着人们对其益生功能认识的深入，对益生菌的研究和应用愈发受到重视，人们对食品加工的需求也越来越向绿色和天然等理念转变。在这种情况下，益生菌代替化学防腐剂达到食品防腐保鲜，代替抗生素作为饲料添加剂喂食畜禽[7-9]以改善其生长性能以及作为疾病治疗的新型手段逐步进入人们的视野。而乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)作为微生物学中公认的益生菌，被公认为是安全的(generallyrecognizedassafe，GRAS)食品级微生物，对人畜健康绝对安全。正是由于乳酸菌及其代谢产物的安全和益生特性，使其应用于食品以及饲料中具有很好的可行性，控制不良细菌的生长能以食品级和更自然的方式发生。乳酸菌是一类能发酵碳水化合物产生乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称。乳酸菌一般性描述为球菌或者杆菌，兼性厌氧。19世纪中叶，法国科学家巴斯德在研究酒变酸的原因时首先发现了乳酸菌。随后J.Lister在1873年分离得到第一个纯培养的乳酸菌。乳酸菌广泛存在于奶类、肉类食品、发酵蔬菜以及水果中，人和动物肠道、口腔等部位也是乳酸菌生长旺盛的地方。乳酸菌除了具有改善人体肠道功能、增强机体免疫力、防止腹泻、降低胆固醇等益生功能外，还可以改善食品的质地风味，提高食品的营养价值，其代谢产生的有机酸、过氧化氢以及细菌素等天然物质还能抑制食品中致病菌的生长，防止食品腐败。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一菌种ZFM54的获取方法，其中所述菌种ZMF54是一种副干酪乳杆菌，其能够作为天然食品防腐剂和抗生素替代品。本专利技术的一个目的在于提供一菌种ZMF54的获取方法，其从初生婴儿粪便中分离乳酸菌，通过初筛得到一株具有广谱抗菌作用的乳酸菌优势菌株，经过排除有机酸、过氧化氢和酶水解的复筛试验确定该菌株产生的抑菌物质中含有细菌素这样的蛋白质或多肽，利用生理生化鉴定和16SrDNA序列分析对该菌株进行种属鉴定。本专利技术的一个目的在于提供一菌种ZMF54的获取方法，其中所述菌种ZFM54对藤黄微球菌10209、单增李斯特氏菌LM1等革兰氏阳性菌和大肠杆菌DH5、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50015等革兰氏阴性菌均有抑菌效果且抑菌活性较强。本专利技术的一个目的在于提供一菌种ZMF54的获取方法，其中通过设计复筛实验来排除有机酸和H2O2的干扰，鉴定其产生抑菌效果的是一类蛋白质或者多肽。本专利技术的一个目的在于提供一菌种ZFM54的获取方法，其中所述菌种ZFM54发酵上清液中的抑菌物质对胰蛋白酶和蛋白酶K非常敏感，胃蛋白酶也可使其失去部分活性。本专利技术的一个目的在于提供一菌种ZMF54的获取方法，其结合形态学鉴定、生理生化鉴定和16SrDNA同源性分析，鉴定筛选出ZFM54菌株。本专利技术的一个目的在于提供一菌种ZFM54的获取方法，其中所述菌种ZFM54产细菌素。本专利技术的一方面提供一菌种ZFM54的获取方法，其包括：(A)从婴儿粪便中分离乳酸菌；(B)菌种的活化和保藏；(C)指示菌的培养；(D)乳酸菌初筛；(E)产细菌素乳酸菌复筛；以及(F)菌种鉴定。根据一个实施例所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(A)中，在无菌条件下，取初生婴儿粪便用1mL灭菌生理盐水稀释，振荡使其充分混匀后静置，取100μL上清涂布到添加有2％碳酸钙的MRS固体培养基平板上，倒置于37℃培养箱中厌氧培养36～48h。根据一个实施例所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(B)中，初步判定为乳酸菌的单菌落，接种到10mLMRS液体培养基中于37℃条件下培养24h，再以1％(v/v)的接种量进行两次传代培养，活化后编号保种，取700μL菌液加上300μL灭菌甘油于-80℃保藏菌株。根据一个实施例所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(C)中，将保藏在-80℃甘油管中的各指示菌菌种，分别划线于LB固体培养基平板上，在各自的最适温度下培养至出现明显单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇床振荡培养至对数期。根据一个实施例所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(D)中，将活化好的乳酸菌菌株按照1％比例分别接种于10mLMRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24h后，4℃下8000r/min离心20min获得上清液，发酵上清液采用牛津杯琼脂扩散法测试抑菌活性。根据一个实施例所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(E)中包括步骤：排除有机酸的干扰，首先测定ZFM54发酵上清液的pH，然后用1M氢氧化钠溶液将发酵上清液调至pH5.0，以用乳酸和醋酸调至相同pH的无菌MRS培养基为对照，对藤黄微球菌10209进行牛津杯琼脂扩散法抑菌试验，测量抑菌圈直径大小，比较抑菌活性区别。根据一个实施例所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(E)中包括步骤：排除过氧化氢的干扰，将发酵上清液浓缩两倍后调节pH值到原来的发酵上清pH值，配制浓度为5mg/mL的过氧化氢酶工作液，按发酵上清浓缩液与过氧化氢酶工作液体积比为1∶1进行混合，在37℃水浴处理2h后采用牛津杯法测试其抑菌活性；同时用以1∶1混合的发酵上清浓缩液和pH7.0的PBS缓冲液作为空白对照，分别测量抑菌圈直径大小并比较区别。根据一个实施例所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(F)中包括步骤：细菌素类物质的确定，配制胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的酶溶液5mg/mL，将发酵上清液分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一菌种ZFM54的获取方法，其特征在于，包括：/n(A)从婴儿粪便中分离乳酸菌；/n(B)菌种的活化和保藏；/n(C)指示菌的培养；/n(D)乳酸菌初筛；/n(E)产细菌素乳酸菌复筛；以及/n(F)菌种鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一菌种ZFM54的获取方法，其特征在于，包括：
(A)从婴儿粪便中分离乳酸菌；
(B)菌种的活化和保藏；
(C)指示菌的培养；
(D)乳酸菌初筛；
(E)产细菌素乳酸菌复筛；以及
(F)菌种鉴定。


2.根据权利要求1所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(A)中，在无菌条件下，取初生婴儿粪便用1mL灭菌生理盐水稀释，振荡使其充分混匀后静置，取100μL上清涂布到添加有2％碳酸钙的MRS固体培养基平板上，倒置于37℃培养箱中厌氧培养36～48h。


3.根据权利要求1所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(B)中，初步判定为乳酸菌的单菌落，接种到10mLMRS液体培养基中于37℃条件下培养24h，再以1％(v/v)的接种量进行两次传代培养，活化后编号保种，取700μL菌液加上300μL灭菌甘油于-80℃保藏菌株。


4.根据权利要求3所述的菌种ZFM54的获取方法，其中MRS培养基：牛肉膏10g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，柠檬酸三铵3g，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801mL，溶于超纯水并定容至1L，调节培养基pH为6.5，121℃高压灭菌15min。


5.根据权利要求3所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(C)中，将保藏在-80℃甘油管中的各指示菌菌种，分别划线于LB固体培养基平板上，在各自的最适温度下培养至出现明显单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇床振荡培养至对数期。


6.根据权利要求5所述的菌种ZFM54的获取方法，其中LB培养基：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，超纯水溶解并定容至1L，调节培养基pH为7，121℃高压灭菌15min。


7.根据权利要求1所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(D)中，将活化好的乳酸菌菌株按照1％比例分别接种于10mLMRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24h后，4℃下8000r/min离心20min获得上清液，发酵上清液采用牛津杯琼脂扩散法测试抑菌活性。


8.根据权利要求7所述的菌种ZFM54的获取方法，其中牛津杯琼脂扩散法测试方法包括步骤：(1)将灭过菌的LB半固体培养基加热使其充分融化，轻轻振荡混匀，并置于55℃水浴锅中恒温防止琼脂凝固；(2)将灭过菌的牛津杯间隔均匀地放置在一次性培养皿上；(3)将指示菌在漩涡振荡器中振荡混匀，待LB半固体培养基冷却到45℃左右后按1％(v/v)的接种量将指示菌菌悬液加入到15mL半固体培养基中，充分混匀后倒入培养皿中，轻轻旋转平皿使其均匀覆盖平皿表面，注意不要将培养基倒入牛津杯中；(4)待半固体培养基完全冷却凝固后，用灭菌的镊子将牛津杯小心拔出，制成带圆柱形孔洞的含菌平板；(5)在每个孔洞中加入100μL待测样品后，将平板置于4℃冰箱使样品充分扩散4h，然后按照不同指示菌各自的最适培养条件培养12h；(6)用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。


9.根据权利要求1所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(E)中包括步骤：排除有机酸的干扰，首先测定ZFM54发酵上清液的pH，然后用1M氢氧化钠溶液将发酵上清液调至pH5.0，以用乳酸和醋酸调至相同pH的无菌MRS培养基为对照，对藤黄微球菌10209进行牛津杯琼脂扩散法抑菌试验，测量抑菌圈直径大小，比较抑菌活性区别。


10.根据权利要求1所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(E)中包括步骤：排除过氧化氢的干扰，将发酵上清液浓缩两倍后调节pH值到原来的发酵上清pH值，配制浓度为5mg/mL的过氧化氢酶工作液，按发酵上清浓缩液与过氧化氢酶工作液体积比为1:1进行混合，在37℃水浴处理2h后采用牛津杯法测试其抑菌活性；同时用以1:1混...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾青，顾容铖，
申请(专利权)人：顾青，
类型：发明
国别省市：浙江;33