一种糖醇体外肠道微生物评价方法技术

本发明专利技术涉及一种糖醇体外肠道微生物评价方法，通过体外混菌评价装置，利用物理调控，以及pH和OD双反馈系统以及利用粘膜小球去模拟人体的黏液层，从而能够模拟更加真实的结肠环境，且微生物的数量种类组成于人体结肠有高度的相似性。采用单双三菌培养去实现代谢估算模型，通过体外模拟发酵系统CDMN模型获得的数据进行相关性分析和随机数森林方法选择出在糖醇代谢中更为重要的多种菌群进行单双三菌培养，而不是单纯的选择乳酸菌或双歧杆菌进行实验。这样的方法能够获得更真实且有效的数据。而且在双三菌培养中能够探究获得肠道微生物菌群之间利用糖醇共生滋养的数据，弥补了单菌实验的不足，这更有助于实现更真实的代谢估算模型。

An in vitro evaluation method for intestinal microorganisms of glycols

【技术实现步骤摘要】
一种糖醇体外肠道微生物评价方法
本专利技术属于糖醇体外肠道微生物评价
，特别一种糖醇体外肠道微生物评价方法。
技术介绍
现有对微生物利用糖醇的研究方向及技术路线主要涉及的是乳酸菌和双歧杆菌等单菌研究，即糖醇如何影响这些单菌的代谢活动及代谢产物的产生。但是在人体消化及自然界中，糖醇相应的转化和利用是在复杂的微生态中进行。比如糖醇在被肠道中的微生物利用情况原比单菌利用复杂的多，究其原因是因为肠道微生物在利用糖醇等其他益生元存在一种共生滋养的作用。同时相应代谢产生的物质如短链脂肪酸对人体的健康有极大的影响。因此糖醇在复杂微生物体系中利用的研究相对于单菌研究更为重要。现有的动物实验因为其肠道微生物组成与人体的肠道微生物有差异性，因此实验结果不能很好的反应人体的代谢情况和菌群数据。人体实验虽然能够了解人体的代谢情况，但是结果只反应了直肠的信息，并不能获取结肠部分的菌群及其代谢产物的数据，且很难得到动态的数据变化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种糖醇体外肠道微生物评价方法，利用人体粪便进行体外模拟，因此相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糖醇体外肠道微生物评价方法，其特征在于，包括如下步骤：采用体外混菌评价装置，向体外混菌评价装置中通过串联管路依次连通的补料罐、前发酵罐、中间发酵罐和后发酵罐内分别加入预先配制的培养液，将预先提取的粪便微生物菌液和事先制备的粘膜小球分别加入到前发酵罐、中间发酵罐和后发酵罐中，每日通过补料罐和串联管路向前发酵罐、中间发酵罐和后发酵罐补充部分培养液，并从后发酵罐排出等量的废液，直至各个发酵罐内的微生物趋于稳定；再向补料罐中加入要评价的糖醇的溶液，重复补充部分培养液和排出等量的废液的过程连续七天后停止；对每天收集的各个发酵罐中的发酵液和被替换的黏膜小球样品中肠道微生物的组成及分布进行测定，检测...

【技术特征摘要】
1.一种糖醇体外肠道微生物评价方法，其特征在于，包括如下步骤：采用体外混菌评价装置，向体外混菌评价装置中通过串联管路依次连通的补料罐、前发酵罐、中间发酵罐和后发酵罐内分别加入预先配制的培养液，将预先提取的粪便微生物菌液和事先制备的粘膜小球分别加入到前发酵罐、中间发酵罐和后发酵罐中，每日通过补料罐和串联管路向前发酵罐、中间发酵罐和后发酵罐补充部分培养液，并从后发酵罐排出等量的废液，直至各个发酵罐内的微生物趋于稳定；再向补料罐中加入要评价的糖醇的溶液，重复补充部分培养液和排出等量的废液的过程连续七天后停止；对每天收集的各个发酵罐中的发酵液和被替换的黏膜小球样品中肠道微生物的组成及分布进行测定，检测样品中短链脂肪酸浓度以及各个发酵罐的发酵气体的成分分布，对获得的检测数据进行分析，找出与要评价的糖醇代谢密切相关的多种主要菌群；对多种主要菌群的菌液进行菌落数评价实验。


2.如权利要求1所述的糖醇体外肠道微生物评价方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、准备体外混菌评价装置：设置至少三个发酵罐和一个补料罐，其中发酵罐包括至少一个前发酵罐、至少一个中间发酵罐和至少一个后发酵罐，在每个发酵罐上分别设有输入酸液或碱液的输液管、输入惰性气体的输气管和搅拌装置，前发酵罐、中间发酵罐和后发酵罐依次通过连接管路串联，在后发酵罐上设有输出管路，在补料罐上设有补料管与前发酵罐连通；
步骤二、收集粪便微生物菌液：称取新鲜粪便用pH6.8缓冲液进行搅拌溶解，纱布过滤掉固体颗粒，所得滤液即为含粪便微生物的菌液；
步骤三、制备粘膜小球：将琼脂加入蒸馏水中加热溶解，再混入黏液素，调节混合液的pH为6.8，灭菌，将混合溶液转移到球形磨具中制备黏膜小球；
步骤四、配制培养液：将玉米淀粉、蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨、黏液素、L-半胱氨酸盐酸盐、3号胆盐、血红素、氯化钠、吐温、氯化钾、磷酸二氢钾、六水氯化镁、六水氯化钙和微量元素储备液的各组分进行混合以配制培养液，其中，微量元素储备液包含七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、二水氯化钙、四水氯化锰、七水硫酸钴、五水硫酸铜、七水硫酸锌、六水氯化镍的组分；
步骤五、建立体外模拟发酵系统CDMN：
(1)将步骤四制备的培养液分别加入到步骤一的补料罐、前发酵罐、中间发酵罐和后发酵罐中并通过输液管调节各个发酵罐的pH值；
(2)将步骤二制备的粪便微生物菌液分别接入到各个发酵罐中，向每个发酵罐中加入步骤三制备的黏膜小球，启动每个发酵罐上的搅拌装置对发酵液进行搅拌；
(3)接种培养24h之后，每日由补料罐通过补料管向前发酵罐补给部分培养液，并通过中间发酵罐、连接管路和输出管路从后发酵罐排出等量废液，以维持各个发酵罐内培养液体积不变，每日用新的黏膜小球分别替换各个发酵罐中的部分黏膜小球，每日早、中、晚对每个发酵罐通过输气管通入氮气以排尽发酵罐内的空气，直至各个发酵罐内的微生物趋于稳定；
(4)向补料罐中加入要评价的糖醇的溶液，重复步骤(3)连续7天后停止发酵，分别采集0～7天各个发酵罐中的发酵液和被替换的黏膜小球，收集各个发酵罐的发酵气体；
步骤六、进行体外肠道微生物评价：
(5)找出多种主要菌群：测定步骤(4)得到的各发酵液和粘膜小球样品中肠道微生物的组成及分布，检测各样品中短链脂肪酸浓度以及各个发酵罐的发酵气体的成分分布，对获得的检测数据进行分析，找出与要评价的糖醇代谢密切相关的多种主要菌群；和/或，
(6)进行单菌菌落数评价实验：各取多种主要菌群中的某一单菌菌液分别接入葡萄糖GAM培养基、要评价的糖醇GAM培养基、混糖(含有葡萄糖和要评价的糖醇)GAM培养基、无糖(或称无碳源)GAM培养基中，分别混匀后各取1.8mL样品作为0h初始样品，然后将样品放置于培养箱里培养，每隔2h～4h取一次样，测算并记录样品中菌群的菌落数，直到60h。


3.如权利要求2所述的糖醇体外肠道微生物评价方法，其特征在于，在步骤一中，在输液管、输出管路、连接管路和补料管上分别设置了蠕动泵。


4.如权利要求2所述的糖醇体外肠道微生物评价方法，其特征在于，在步骤一中，在补料罐和每个发酵罐上分别设有调节培养液温度的调温装置。


5.如权利要求2至4中任意一项所述的糖醇体外肠道微生物评价方法，其特征在于，在步骤六的进行体外肠道微生物评价中还包括如下步骤：和/或，
(7)对多种主要菌群中的任意两种分别采用与步骤(6)相同的评价实验方法进行双菌菌落数评价实验；和/或，

【专利技术属性】
技术研发人员：朱炫，向沙沙，石丽华，叶昆，李勉，
申请(专利权)人：浙江华康药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33