一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用多肽标志物区分西洋参和人参物种的方法，包括下述步骤：西洋参与人参提取物经液相色谱分离后通过质谱分析；采集质谱数据并通过数据处理软件对齐每个特征的m/z，滞留时间，峰强度等；使用提取目标多肽色谱峰的分析方法确定西洋参和人参的共有多肽以及多肽标志物；基于液质联用分析对西洋参和人参的目标多肽进行质量和碎片离子的匹配，实现表征；使用多肽标志物对西洋参和人参进行鉴定，并通过西洋参标志物皂苷F11和人参标志物皂苷Rf验证鉴定结果。利用本发明专利技术的方法可以快速地、准确地将人参和西洋参的生物标志物寻找出来并用来鉴定未知样本。

A method of distinguishing American ginseng and ginseng by using polypeptide markers

【技术实现步骤摘要】
一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法
本专利技术属于植物多肽及生物
，涉及一种从植物复杂成分中有效筛选多肽标志物并用于区分相似物种，并通过现代质谱技术表征多肽标志物。
技术介绍
西洋参和人参具有相似的化学成分和药理活性，但两种人参物种之间的化学差异尚未得到充分阐明。文献中已经报道的西洋参的标志物皂苷F11和人参的标志物皂苷Rf具有相同的分子量，它们在大多数LC条件下通常共洗脱。并且文献中报道亚洲人参中存在微量的F11。因此，有限的西洋参和人参的标志物不能用于完全描绘两种物种之间的化学差异，可能会发生西洋参和人参的错误识别，需要建立可分辨的新的标志物以区分人参属物种。特征标志物定义为在独特物种中可检测到，多肽能够有效地研究基因的动态表达，可能具有新的治疗选择的潜力，是有前途的理想候选标志物。良好的生物标志物具有高灵敏度(识别真阳性的可能性)和特异性(确认真阴性的可能性)，从而提供明确的确认/排除信息。使用液质分析具有高分辨率，高灵敏度和高通量，可以发现新的多肽，依赖于蛋白质数据库的持续更新,在多肽的研究中具有很大的潜力。
技术实现思路
本专利技术公开了一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法，包括下述步骤：西洋参与人参提取物经液相色谱分离后通过质谱分析；采集质谱数据并通过数据处理软件对齐每个特征的m/z，滞留时间(Retentiontime)，峰强度等筛选多肽候选物；使用提取目标多肽色谱峰的分析方法确定西洋参和人参的共有多肽以及多肽标志物；基于液质联用分析对西洋参和人参的目标多肽进行质量和碎片离子的匹配，实现表征；使用多肽标志物对西洋参和人参进行鉴定，并通过西洋参标志物皂苷F11和人参标志物皂苷Rf验证鉴定结果。利用本专利技术的方法可以快速地、准确地将人参和西洋参的多肽标志物寻找出来并用来鉴定未知样本，这些生物标志物将为药理研究和掺假预防提供科学依据，同时也为其他中药材寻找生物标记物提供新的思路和方法。获得的关于西洋参和人参中特定肽表达的知识构成了我们未来努力的基础。本专利技术提供了一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法，所述方法至少包括以下步骤：a)制备西洋参和人参化合物的提取液；b)通过液质联用对所述西洋参和所述人参的提取液进行非靶向分析；c)通过数据处理软件对步骤b)采集得到的数据进行预处理筛选多肽候选物；d)依次提取步骤c)得到的候选多肽的色谱峰的分析方法，以确定西洋参和人参的共有多肽及各自的多肽标志物；e)通过液质联用对所述共有多肽及多肽标志物进行二级碎裂；f)通过数据库检索对所述共有多肽及多肽标志物进行表征；g)对待测样本进行所述a)和b)的操作，获得待测样本的质谱数据，通过步骤d)得到的多肽标志物判断待测样本属于西洋参或人参并进行验证。在优选的实施方式中，所述步骤a)包括：1)将西洋参或人参样本中加入体积比为0％-80％乙醇水溶液为提取溶剂，样本粉末与溶剂的质量体积比为0.1g/ml-0.4g/ml；2)将步骤1)中的混合物超声分离，收集溶剂；3)将步骤2)所得溶液在氮气氛下干燥，然后将所得干燥物用水重新溶解，离心收集上清。在优选的实施方式中，所述步骤b)采用二元梯度洗脱系统，其中，流动相A为浓度为0.2％～0.5％的甲酸水，B为乙腈。洗脱梯度如下：0min:2～5％B,流速0.3～0.4mL/min；5～7min:100％B,流速0.3～0.4mL/min；在色谱柱温为40℃-60℃下进行色谱分离；进样体积为1-5μl。在优选的实施方式中，所述步骤c)通过ProgenesisQI软件对质谱仪采集到的数据进行预处理，筛选出候选肽的电荷数是4<z<7的多电荷离子。优选地，所述预处理包括对特征峰的m/z和滞留时间进行对齐和相同的特征进行合并中的至少一种。在优选的实施方式中，在所述步骤d)中，通过所述多电荷离子判断西洋参和人参的共有多肽以及各自的多肽标志物，将所述共有多肽以及各自的多肽标志物的离子从总离子流图上提取出来，以绘制肽谱。在优选的实施方式中，在所述步骤e)，筛选出共有多肽以及各自的多肽标志物进行靶向二级碎裂表征，所述液质联用包括二元洗脱系统，其中流动相A为浓度为0.2％～0.5％的甲酸水，B为乙腈；洗脱梯度如下：0min:2～5％B,流速0.3～0.4mL/min；5～7min:100％B,流速0.3～0.4mL/min；在色谱柱温为40℃-60℃下进行色谱分离；进样体积为1-5μl。优选地，选择碰撞诱导解离和碰撞解离碎裂，归一化碰撞能量设定为20％-50％。在优选的实施方式中，在所述步骤f)中通过蛋白组学质谱数据分析软件，利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，进行denovo从头测序和搜索数据库。优选地，所述蛋白质组学质谱数据分析软件进行过滤、解卷积、二级质谱图简化、从头测序和搜索数据库以确定多肽的一级结构。在优选的实施方式中，在所述步骤g)中，分别提取待测样本的步骤d)得到的多肽标志物的色谱图，以判断待测样本属于西洋参或人参。在优选的实施方式中，在所述步骤b)和e)，质谱采集为正离子模式。在优选的实施方式中，在所述步骤g)中所述方法还包括使用已知的西洋参的皂苷标志物F11和人参的皂苷标志物Rf来验证所述多肽标志物，质谱采集为负离子模式。本申请能产生的有益效果包括：1)本专利技术建立了基于液质联用技术，发现了多肽标志物可用于西洋参和人参的鉴别；2)通过未知的大量的药材样本，监测已知的皂苷标志物(包括皂苷Rf和F11)，验证了这些多肽标志物的可靠性，为进一步的药理学研究和临床应用提供理论基础；3)本专利技术使用液质联用为分析检测手段，具有高通量和高灵敏度，分离度好和分析速度快，有助于多肽的发现和表征；4)本专利技术通过ProgenesisQI软件处理质谱数据，ESI源的电离过程会使大部分多肽带有多电荷(z>1)，据此特征，可以快速筛选多肽；5)报道的标志物F11和Rf具有相同的分子量，它们通常在大多数LC条件下共洗脱，亚洲人参中还存在微量的F11。已知的标志物不能用于完全描绘两种物种之间的化学差异。本专利技术研究的多肽广泛参与生物系统，它们能够有效地研究基因的动态表达，多肽标志物具有新的治疗选择的潜力，是有前途的理想候选者；6)本专利技术对西洋参和人参的多肽标志物的发现和表征有助于了解这两种相似草药的药理活性，为药理研究和掺假预防提供科学依据，适用于未来西洋参和人参在加工过程中的质量控制；7)本专利技术所建立的使用多肽标志物区分人参和西洋参属种的通用技术体系，可辐射应用到植物和微生物代谢组学分析、食品安全代谢组学分析等领域。附图说明图1-1使用线性溶剂A/溶剂B洗脱梯度以正离子模式记录人参样品的总离子色谱图。图1-2使用线性溶剂A/溶剂B洗脱梯度以正离子模式记录西洋参样品的总离子色谱图。图2-1代表西洋参标志物B1的提取色谱图，前5个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：/na)制备西洋参和人参化合物的提取液；/nb)通过液质联用对所述西洋参和所述人参的提取液进行非靶向分析；/nc)通过数据处理软件对步骤b)采集得到的数据进行预处理筛选多肽候选物；/nd)依次提取步骤c)得到的候选多肽的色谱峰的分析方法，以确定西洋参和人参的共有多肽及各自的多肽标志物；/ne)通过液质联用对所述共有多肽及多肽标志物进行二级碎裂；/nf)通过数据库检索对所述共有多肽及多肽标志物进行表征；/ng)对待测样本进行所述a)和b)的操作，获得待测样本的质谱数据，通过步骤d)得到的多肽标志物判断待测样本属于西洋参或人参并进行验证。/n

【技术特征摘要】
1.一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：
a)制备西洋参和人参化合物的提取液；
b)通过液质联用对所述西洋参和所述人参的提取液进行非靶向分析；
c)通过数据处理软件对步骤b)采集得到的数据进行预处理筛选多肽候选物；
d)依次提取步骤c)得到的候选多肽的色谱峰的分析方法，以确定西洋参和人参的共有多肽及各自的多肽标志物；
e)通过液质联用对所述共有多肽及多肽标志物进行二级碎裂；
f)通过数据库检索对所述共有多肽及多肽标志物进行表征；
g)对待测样本进行所述a)和b)的操作，获得待测样本的质谱数据，通过步骤d)得到的多肽标志物判断待测样本属于西洋参或人参并进行验证。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)包括：
1)将西洋参或人参样本中加入体积比为0％-80％乙醇水溶液为提取溶剂，样本粉末与溶剂的质量体积比为0.1g/ml-0.4g/ml；
2)将步骤1)中的混合物超声分离，收集溶剂；
3)将步骤2)所得溶液在氮气氛下干燥，然后将所得干燥物用水重新溶解，离心收集上清。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)采用二元梯度洗脱系统，其中，流动相A为浓度为0.2％～0.5％的甲酸水，B为乙腈；
洗脱梯度如下：0min:2～5％B,流速0.3～0.4mL/min；5～7min:100％B,流速0.3～0.4mL/min；在色谱柱温为40℃-60℃下进行色谱分离；进样体积为1-5μl。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)通过ProgenesisQI软件对质谱仪采集到的数据进行预处理，筛选出候选肽的电荷数是4<z<7的多电荷离子；
优选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓哲，赵强，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21