基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法技术

本发明专利技术涉及生物组织样本整体染色、三维成像领域，具体涉及一种基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法；该方法向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于的多聚甲醛溶液中固定；用缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗；将小肠组织分别置于不同体积分数的乙醇溶液中进行脱水；超声处理；超声漂洗；将石蜡块放在真空泵加热，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中，抽真，然后进行缓慢降温；将制作好的石蜡包埋样品置于在PBS缓冲液水槽中，利用TDI～fMOST相机进行采集。本发明专利技术借助超声加热的方式将Dil染料快速的渗透到组织内部，从而实现脏器组织大样本的整体染色。

Three dimensional imaging method of biological tissue samples based on DIL ultrasonic staining

【技术实现步骤摘要】
基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法
本专利技术涉及生物组织样本整体染色、三维成像领域，具体涉及一种基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法。
技术介绍
Dil细胞膜红色荧光探针(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)；DiI的分子式为C59H97ClN2O4，分子量为933.88是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光，最大激发波长549nm，最大发射波长565nm。Dil在细胞膜外呈现弱的荧光特性，与细胞膜或者单位膜结合后则呈现很强的荧光特性，并可沿着单位膜做侧向扩散，逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。它的荧光强而稳定，不影响被标记细胞的存活和生长，在标记细胞内消失慢，因此可以作为一种独特细胞膜(单位膜)标记物。作为神经科学研究领域中常用的荧光示踪剂，可以清晰揭露神经元精细的形态结构，如胞体、轴突、树突及树突棘等，Dil除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移、检测细胞毒性和标记脂蛋白。Dil作为细胞膜荧光示踪剂的缺点：Dil不足之处是染色扩散速度较慢，在活体的扩散速度平均为每天4～6mm，而在固定的脑组织中扩散速度仅为每天400μm，一般最大扩散距离仅10～12mm，因此Dil很难对整体生物组织样品进行快速的标记。传统石蜡切片的缺点：传统的石蜡切片后染色不仅效果不佳，还存在损失，轴向分辨率低，很难对切片再次进行三维重构，不能确保整体组织的完整性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法；该方法利用Dil染料能与膜结合后呈现很强的荧光特性，及其超声加热渗透的方法，对生物组织器官进行整体染色，利用TDI～fMOST成像对生物样本整体染色，连续切片断层成像的方法，其中的染色方法可以清晰的显示器官内部细胞层面立体的效果，具有快速、经济、高质量的特点。为实现上述目的，本专利技术所设计一种基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法，包括以下步骤：1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为3～5％的多聚甲醛溶液中固定6～24h；2)用0.05～0.2M的PBS缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗20～60min；漂洗2～4次；3)将小肠组织分别置于不同体积分数的乙醇溶液中进行脱水；4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度0.1～0.3ug/mLDil工作液中，在超声条件下进行超声处理；5)将小肠组织置于无水乙醇中超声漂洗，重复2～4次；6)将小肠组织置于二甲苯透明1～3次，每次0.5～2h；7)将石蜡块放在真空泵加热到65～70℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中3～5h，抽真，然后进行缓慢降温；8)将制作好的石蜡包埋样品置于在0.05～0.2M的PBS缓冲液水槽中，利用TDI～fMOST相机进行采集(水镜成像)。进一步地，所述步骤1)中，多聚甲醛溶液的质量分数为4％，固定时间12h。再进一步地，所述步骤2)中，PBS缓冲液的浓度为0.1M，漂洗时间为30min；漂洗3次。再进一步地，所述步骤3)中，将小肠依次置于体积分数为50％、75％、95％的乙醇溶液中，脱水1h。再进一步地，所述步骤4)中，超声波的功率密度为1.00W/cm2～1.50W/cm2,频率为28kHz～43kHz；超声处理的时间为1～3h。再进一步地，所述步骤4)中，超声波的功率密度为1.50W/cm2,频率为35kHz；超声处理的时间为2h。再进一步地，所述步骤5)中，超声波的功率密度为1.00W/cm2～1.50W/cm2,频率为28kHz～43kHz；超声处理的时间为1～3h再进一步地，所述步骤5)中，超声波的功率密度为1.50W/cm2,频率为35kHz；超声处理的时间为2h。上述Dil染料工作液配制：购置10mgDil染料(产品编号：C1063上海碧云天生物技术有限公司)，用无水乙醇配置成1mg/mL的储存液于-20℃避光保存，配置10mL,10ug/mL的工作液，本专利技术的有益效果：1)本专利技术利用无水乙醇配置Dil染料的工作液，既能达到溶解Dil的效果，又能在超声震荡的过程中对组织样本进行脱水；2)本专利技术针对Dil染色扩散速度较慢，很难实现生物组织大样本的整体染色的缺陷；本专利技术借助超声加热的方式(间隔式超声，避免持续超声过程中样本的龟裂)将Dil染料快速的渗透到组织内部，从而实现脏器组织大样本的整体染色；3)本专利技术针对传统的石蜡切片制作过程切片、裱片、成像、数据质量无保障(手工切片、数据易损、难配准)，只能获得低轴向分辨率的成像结果的缺陷；本专利技术借助TDI-fMOST(荧光显微光学断层成像仪)对石蜡包埋的样品进行边切削，边用PBS漂洗，边采集的方法实现对整体Dil染色石蜡样品进行成像；从而获取1-10μm一层整体小肠三维结构图。附图说明图1为本专利技术实施提供的小鼠小肠精细切面图；图2为本专利技术实施提供的小鼠小肠连续切面图，2μm一层；图3为提供的小鼠小肠的立体三视图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。实施例1基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法，包括以下步骤：1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为4％的多聚甲醛溶液中固定12h；2)用0.1M的PBS缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗30min；漂洗3次；3)将小肠组织分别置于体积分数为50％、75％、95％的乙醇溶液中，分别脱水1h；4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度0.2μg/mLDil工作液中，在在功率密度为1.00W/cm2～1.50W/cm2,频率为28kHz～43kHz条件下进行超声处理1～3h；5)将小肠组织置于无水乙醇中在功率密度为1.00W/cm2～1.50W/cm2,频率为28kHz～43kHz条件下超声漂洗1～3h，重复2～4次；6)将小肠组织置于二甲苯，透明2次，每次1h；7)将石蜡块放在真空泵加热到65～70℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中3～5h，抽真，然后进行缓慢降温；8)将制作好的石蜡包埋样品置于在0.05～0.2M的PBS缓冲液水槽中，利用TDI～fMOST相机进行采集(水镜成像)。如图1～3所示：借助TDI-fMOST(荧光显微光学断层成像仪)对石蜡包埋的样品进行边切削，边用PBS漂洗，边采集的方法实现对整体Dil染色石蜡样品进行成像；从而获取1-10μm一层整体小肠三维结构图。实施例2基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法，包括以下步骤：1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为3～5％的多聚甲醛溶液中固定6～24h；/n2)用0.05～0.2M的PBS缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗20～60min；漂洗2～4次；/n3)将小肠组织分别置于不同体积分数的乙醇溶液中进行脱水；/n4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度0.1～0.3μg/mL Dil工作液中，在超声条件下进行超声处理；/n5)将小肠组织置于无水乙醇中超声漂洗，重复2～4次；/n6)将小肠组织置于二甲苯，透明1～3次，每次0.5～2h；/n7)将石蜡块放在真空泵加热到65～70℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中3～5h，抽真，然后进行缓慢降温；/n8)将制作好的石蜡包埋样品置于在0.05～0.2M的PBS缓冲液水槽中，利用TDI～fMOST相机进行采集。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为3～5％的多聚甲醛溶液中固定6～24h；
2)用0.05～0.2M的PBS缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗20～60min；漂洗2～4次；
3)将小肠组织分别置于不同体积分数的乙醇溶液中进行脱水；
4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度0.1～0.3μg/mLDil工作液中，在超声条件下进行超声处理；
5)将小肠组织置于无水乙醇中超声漂洗，重复2～4次；
6)将小肠组织置于二甲苯，透明1～3次，每次0.5～2h；
7)将石蜡块放在真空泵加热到65～70℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中3～5h，抽真，然后进行缓慢降温；
8)将制作好的石蜡包埋样品置于在0.05～0.2M的PBS缓冲液水槽中，利用TDI～fMOST相机进行采集。


2.根据权利要求1所述基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：所述步骤1)中，多聚甲醛溶液的质量分数为4％，固定时间12h。


3.根据权利要求1所述基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：程柯，郑廷，陈谦，李龙辉，毛珂，
申请(专利权)人：武汉沃亿生物有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42