本发明专利技术公开了一种基因工程大肠杆菌及制备方法和吲哚‑3‑乙酸的生产方法。本发明专利技术的基因工程大肠杆菌包含色氨酸‑2‑单加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因，且所述色氨酸‑2‑单加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因能够在所述大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸‑2‑单加氧酶iaaM和具有活性的酰胺酶ami1。本发明专利技术可以获得生产吲哚‑3‑乙酸的基因工程大肠杆菌。
Gene engineering Escherichia coli and its preparation method and production method of indole-3-acetic acid
【技术实现步骤摘要】
基因工程大肠杆菌及制备方法和吲哚-3-乙酸的生产方法
本专利技术涉及一种基因工程大肠杆菌及制备方法和吲哚-3-乙酸的生产方法。
技术介绍
吲哚-3-乙酸(indole-3-aceticacid,IAA),化学式C10H9NO2，又称为植物生长素，是植物生长和发育过程中必不可少的一种植物激素。IAA可以激发和调控植物体内众多生化过程，比如通过刺激细胞分裂调节植物分生组织以形成横向不定根等新器官；促进细胞伸长来促进器官的分化和形成；维持植物的向光性、向地性和极性运输；控制植物代谢和衰老；对病原菌、干旱、重金属及其螯合物的胁迫缓解和作出应答等。此外，生长素还可以通过与其他激素的相互作用调节植物修复等其他生理活动。植物除了通过自身合成获得IAA外，还可以通过如植物中的内生菌等多种微生物来产生IAA，如假单胞菌(Pseudomonassp.)、固氮菌(Azotobactersp.)和固氮螺菌(Azospirillumsp.)等。目前，国内外对IAA生产提取的研究主要集中在植物中提取和微生物合成方面。CN101914053B公开了一种从海藻中制备吲哚乙酸的方法，其通过将海藻浸泡、大孔树脂吸附、解吸、浓缩、高速逆流色谱纯化、结晶等步骤获得IAA。CN102888375B公开了一株能促进兰花组培苗生长及种子萌发的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌(Mycobacteriumavium)Mya-zh01。该菌株来源于蝴蝶兰花梗，经分离、纯化获得。CN106754516A公开了一株具有分泌IAA能力的内生细菌(Lysinibacillusendophyticus)C9T，为酪氨酸芽孢杆菌属新种，其通过可培养方法，经分离、筛选、基因测序、培养等步骤获得，该菌株分泌生长素能力为10.2mg/L。转基因技术也逐渐应用在IAA合成中，例如将特定的基因转入到受体细胞中，使得受体细胞具备IAA合成路径。CN104388369B公开了一种高产吲哚-3-乙酸的重组细胞解淀粉芽孢杆菌菌株SQR9-E和重组枯草芽孢杆菌菌株168-E。通过将吲哚-3-乙酸合成的三种相关蛋白合成基因重组至受体细胞基因，使得受体IAA合成能力得到提高。还有一种方法是将具备IAA合成路径的载体导入特定植物中，使得植物的具备IAA生成能力，或植物IAA分泌能力获得提高，如EP03254645.9公开了一种基因导入植物的载体，该载体包括所需基因和可选标记基因，所述标记基因包括该基因包括编码生长素前体合成生长素的酶的基因吲哚乙酸水解酶iaaH基因和异戊烯基转移酶ipt基因，并且不含色氨酸单加氧酶iaaM基因。植物和特定细菌的IAA生物合成受到复杂的环境胁迫调节，包括pH、渗透胁迫和碳限制等，另外IAA各个合成途径基因的表达方式以及转录调节因子也会限制IAA的合成，所以植物或内生菌株中自发合成IAA的量很少。近年来，生物催化方法取得快速进展，其具有工艺简单、生产周期短、易于放大等优势，有望成为大规模生产IAA的理想途径。但是，现有技术中缺少相关途径的探索和研究，本领域内仍然需要生物合成IAA的新方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种基因工程大肠杆菌，其具有产生色氨酸-2-单加氧酶iaaM和酰胺酶ami1的能力。本专利技术的另一个目的在于提供上述基因工程大肠杆菌的制备方法。本专利技术再一个目的在于提供一种吲哚-3-乙酸(IAA)的生产方法，其利用上述基因工程大肠杆菌进行IAA的生物合成。一方面，本专利技术提供一种基因工程大肠杆菌，其包含色氨酸-2-单加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因，且所述色氨酸-2-单加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因能够在所述基因工程大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸-2-单加氧酶iaaM和具有活性的酰胺酶ami1。根据本专利技术的基因工程大肠杆菌，优选地，所述iaaM基因为来自丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的iaaM基因；所述ami1基因为来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的ami1基因；所述基因工程大肠杆菌源自大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655。根据本专利技术的基因工程大肠杆菌，优选地，所述iaaM基因的碱基序列如SEQIDNO:16所示；所述ami1基因的碱基序列如SEQIDNO:17所示。另一方面，本专利技术提供上述基因工程大肠杆菌的制备方法，包括：使用第一引物从丁香假单胞菌的基因组中扩增得到iaaM基因，使用第二引物以pTrc99A质粒载体为模板扩增得到V-iaaM载体骨架片段，使用第三引物从拟南芥的基因组中扩增得到ami1基因，然后以无缝连接的方式将iaaM基因片段和载体骨架片段V-iaaM进行连接，得到重组质粒pTrc-IAM；使用第四引物以所述重组质粒pTrc-IAM为模板扩增得到V-ami1载体骨架片段，以无缝连接的方式，将所述ami1基因片段和所述V-ami1载体骨架片段进行连接，得到重组质粒pTrc-IAA；以所述ami1基因为模板，使用第五引物扩增出携带有tac启动子的序列ami1-tac片段；以所述重组质粒pTrc-IAA为模板，使用第六引物扩增出pTrc-IAA载体骨架片段；以无缝连接的方式，将所述ami1-tac片段和所述pTrc-IAA载体骨架片段进行连接，得到重组质粒pTrc2-IAA；采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌；使用热激转化的方式将重组质粒pTrc2-IAA转化至化学感受态的大肠杆菌。根据本专利技术的制备方法，优选地，所述第一引物对中各引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；所述第二引物对中各引物的序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；所述第三引物对中各引物的序列分别如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；所述第四引物对中各引物的序列分别如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示；所述第五引物对中各引物的序列分别如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示；所述第六引物对中各引物的序列分别如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示。根据本专利技术的制备方法，优选地，还包括质粒验证步骤，质粒验证使用的引物对中各引物的序列分别如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示。再一方面，本专利技术提供一种吲哚-3-乙酸的生产方法，包括使用如上所述的基因工程大肠杆菌的步骤。根据本专利技术的生产方法，优选地，包括以下步骤：将上述基因工程大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液按一定的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵菌液；向发酵菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体；将诱导菌体与L-色氨酸充分接触，进行全细胞转化，获得吲哚-3-乙酸。根据本专利技术的生产方法，优选地，所述诱导剂选自乳糖、阿拉伯糖和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)其中的一种或多种；所述诱导剂的浓度为0.5～1.5mo本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程大肠杆菌，其特征在于，该基因工程大肠杆菌包含色氨酸-2-单加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因，且所述色氨酸-2-单加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因能够在所述基因工程大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸-2-单加氧酶iaaM和具有活性的酰胺酶ami1。/n
【技术特征摘要】
1.一种基因工程大肠杆菌，其特征在于，该基因工程大肠杆菌包含色氨酸-2-单加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因，且所述色氨酸-2-单加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因能够在所述基因工程大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸-2-单加氧酶iaaM和具有活性的酰胺酶ami1。
2.根据权利要求1所述的基因工程大肠杆菌，其特征在于，所述iaaM基因为来自丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的iaaM基因；所述ami1基因为来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的ami1基因；所述基因工程大肠杆菌源自大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655。
3.根据权利要求1所述的基因工程大肠杆菌，其特征在于，所述iaaM基因的碱基序列如SEQIDNO:16所示；所述ami1基因的碱基序列如SEQIDNO:17所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的基因工程大肠杆菌的制备方法，其包括：
使用第一引物从丁香假单胞菌的基因组中扩增得到iaaM基因，使用第二引物以pTrc99A质粒载体为模板扩增得到V-iaaM载体骨架片段，使用第三引物从拟南芥的基因组中扩增得到ami1基因，然后以无缝连接的方式将iaaM基因片段和载体骨架片段V-iaaM进行连接，得到重组质粒pTrc-IAM；使用第四引物以所述重组质粒pTrc-IAM为模板扩增得到V-ami1载体骨架片段，以无缝连接的方式，将所述ami1基因片段和所述V-ami1载体骨架片段进行连接，得到重组质粒pTrc-IAA；以所述ami1基因为模板，使用第五引物扩增出携带有tac启动子的序列ami1-tac片段；以所述重组质粒pTrc-IAA为模板，使用第六引物扩增出pTrc-IAA载体骨架片段；以无缝连接的方式，将所述ami1-tac片段和所述pTrc-IAA载体骨架片段进行连接，得到重组质粒pTrc2-IAA；
采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌；
使用热激转化的方式将重组质粒pTrc2-IAA转化至化学感受态的大肠杆菌。
【专利技术属性】
技术研发人员：黄建忠，祁峰，吴弘轩，秦丽娜，罗艺献，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。