一种筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法，通过从大肠杆菌MG1655中克隆色氨酸转运RNA基因trpT更改其反密码子环序列，将从大肠杆菌MG1655中克隆组成型启动子llp和终止子rrnB，然后构建含有tRNA与筛选基因的质粒并转入到大肠杆菌C321.ΔA.exp中得到转换的菌体，将转换的菌体富集培养挑选菌体生长最快的菌株作为氨基酸高产菌株，本发明专利技术的方法能够在无需氨基酸类似物的条件下，通过施加细菌内源性的胁迫对色氨酸高产菌株进行筛选，操作过程无毒性试剂，简化筛选流程，降低工作强度。

A method of screening high tryptophan producing Escherichia coli

【技术实现步骤摘要】
一种筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法
本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法。
技术介绍
色氨酸是组成蛋白质的22种标准氨基酸之一，亦是人体必需的八种氨基酸之一。许多动物体内无法合成色氨酸，仅能通过外源摄入获得。当畜禽缺乏色氨酸时，会出现生长停滞，体重下降和脂肪积累降低等情况。L-色氨酸可用作添加剂用于动物饲料中，动物摄入色氨酸可参与其体内血浆蛋白质的更新，促进核黄素发挥作用，增强烟酸及血红素的合成，并可显著增加怀孕动物胎仔体内抗体浓度，对泌乳期的乳牛和母猪有促进泌乳作用，是一种极具应用价值和商业前景的氨基酸。早期人工合成色氨酸的方法主要是利用色氨酸合成酶对吲哚和L-丝氨酸进行一步催化得到L-色氨酸，这也是大多数动植物胞内合成L-色氨酸的主要反应。随后出现了以邻氨基苯甲酸或DL-乙内酰脲为底物转化合成L-色氨酸的工艺。由于上述方法中使用的前体和酶的价格较为昂贵，目前生产色氨酸最经济的方法是以糖为底物进行微生物发酵。3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酸-7-磷酸合酶(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphatesynthase)和邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilatesynthase)是L-色氨酸的生物合成途径中的关键节点。传统方法通过筛选对各种色氨酸类似物具有抗性的突变体，构建能够产生L-色氨酸的菌株。例如黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)的突变体是酪氨酸营养缺陷型，同时有5-氟色氨酸(5-fluorotryptophan)和重氮丝氨酸(azaserine)双重抗性。该方法同样筛选出了酪氨酸和苯丙氨酸双营养缺陷型的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)突变体，其具有5-甲基色氨酸((5-methyltryptophan)，色氨酸异羟肟酸(tryptophanhydroxamate)和酪氨酸异羟肟酸(tyrosinehydroxamate)等6种不同色氨酸类似物的抗性；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的突变体对5-氟色氨酸(5-fluorotryptophan)和吲哚霉素(indolmycin)具有抗性。这些突变菌株在实际发酵能够产生10-15g/L的L-色氨酸。但是，目前所用的色氨酸类似物都对细胞具有极大的毒性，高浓度的类似物会抑制绝大多数细胞的正常生长，从而使能够正常生长的突变体得到富集。这些突变体中既有真正的色氨酸高产菌株，也存在利用外排、降解等方式逃脱筛选压力的突变菌株，导致获得真正的色氨酸高产菌株的过程中需要多轮复筛、逐个鉴别等方法排除假阳性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法，以解决现有技术中筛选方法复杂，需要耗费大量人力资源的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：一种筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1、将大肠杆菌MG1655中查找注释为色氨酸转运RNA基因trpT片段，将反密码子环序列CCA替换为CTA；步骤2、根据色氨酸在不同筛选基因中的含量，将筛选基因中色氨酸密码子TGG替换为终止密码子TAG，得到人工合成的筛选基因；步骤3、将步骤2中得到人工合的筛选基因序列与质粒载体连接，得到用于筛选的质粒，并转化至C321.ΔA.exp突变菌库中得到转化的菌液；步骤4、将步骤3中得到的菌液于培养基中富集培养，并涂于平板培养10h－48h，挑选菌体生长最快的菌株作为氨基酸高产菌株；步骤5、将步骤4中得到的氨基酸高产菌株接种至发酵培养基中，确定最终氨基酸的产量。2、根据权利要求1所述的筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法，其特征在于：所述人工合成的筛选基因所表达的蛋白包括荧光蛋白、显色蛋白或抗生素抗性蛋白。3、根据权利要求2所述的筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法，其特征在于：所述培养基包括：胰蛋白胨5-10g/L，酵母粉1-10g/L，氯化钠5-10g/L。4、根据权利要求3所述的筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法，其特征在于：所述发酵培养基包括：磷酸盐5-20g/L，氯化铵1-10g/L，葡萄糖10-40g/L，氯化钠0.1-5g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙0.015g/L，维生素B15-50μg/L。采用上述技术方案，能够在无需氨基酸类似物的条件下，通过施加细菌内源性的胁迫对色氨酸高产菌株进行筛选，操作过程无毒性试剂，简化筛选流程，降低工作强度。说明书附图图1为本专利技术筛选高产色氨酸大肠杆菌与对照菌株的生长情况对照图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。一种筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法，包括以下步骤：步骤1、筛选质粒的构建：将大肠杆菌MG1655中查找注释为色氨酸转运RNA基因trpT片段，将反密码子环序列CCA替换为CTA，在上下游分别增加lpp启动子与rrnB终止子，使用PCR方法，利用trpT的合成引物进行人工合成。基因全合成体系为：2×A8PCRMasterMix25μL，引物预混液5μL，蒸馏水20μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃变性20秒、60℃退火15秒、72℃延伸10秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。步骤2、构建载体pSK-Trp：从载体pSK上扩增片段用于连接转运RNA基因片段，扩增产物包含转运RNA基因及与载体片段重叠片段20个碱基，并将其连接到pSK载体上。连接体系：1.5μLPCR扩增产物、1μLpSK载体扩增片段，7.5μLGibsonMasterMix(购自NEWENGLANDBioLabs)，轻轻混合，50℃水浴反应60分钟。随后加入50ΜlXL10-GOLD感受态细胞中(购于北京博迈德基因技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激60秒，立刻置于冰上2分钟。加入1000μLSOC培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时，取200μL菌液涂于含有壮观的LB平板上，过夜培养后，经PCR测序验证后将阳性克隆进行液体培养，提取质粒进行测序验证。测序结果表明载体pSK中插入了新合成的转运RNA基因，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pSK-Trp。步骤3、人工合成卡那霉素抗性基因：从Genbank基因库中查询获得卡那霉素抗性基因序列，将6个色氨酸密码子TGG替换为终止密码子TAG，化学合成引物后进行PCR得到kanR-UAG基因序列。采用基因全合成的方法使用kanR-UAG基因序列的合成引物得到序列1所示的卡那霉素抗性基因。基因全合成体系为：2×A8PCRMasterMix25μL，引物预混液5μL，蒸馏水20μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃变性20秒、60℃退本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1、从大肠杆菌MG1655中查找注释为色氨酸转运RNA基因trpT片段，将反密码子环序列CCA替换为CTA；/n步骤2、根据色氨酸在不同筛选基因中的含量，将筛选基因中色氨酸密码子TGG替换为终止密码子TAG，得到人工合成的筛选基因；/n步骤3、将步骤2中得到人工合的筛选基因序列与质粒载体连接，得到用于筛选的质粒，并转化至C321.ΔA.exp突变菌库中得到转换的菌液；/n步骤4、将步骤3中得到的菌液于培养基中富集培养，并涂于平板并培养10h－48h，挑选菌体生长最快的菌株作为氨基酸高产菌株；/n步骤5、将步骤4中得到的氨基酸高产菌株接种至发酵培养基中，确定最终氨基酸的产量。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选高产色氨酸大肠杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、从大肠杆菌MG1655中查找注释为色氨酸转运RNA基因trpT片段，将反密码子环序列CCA替换为CTA；
步骤2、根据色氨酸在不同筛选基因中的含量，将筛选基因中色氨酸密码子TGG替换为终止密码子TAG，得到人工合成的筛选基因；
步骤3、将步骤2中得到人工合的筛选基因序列与质粒载体连接，得到用于筛选的质粒，并转化至C321.ΔA.exp突变菌库中得到转换的菌液；
步骤4、将步骤3中得到的菌液于培养基中富集培养，并涂于平板并培养10h－48h，挑选菌体生长最快的菌株作为氨基酸高产菌株；
步骤5、将步骤4中得到的氨基酸高产菌株接种至发酵培...

【专利技术属性】
技术研发人员：张沨，王新飞，王兴春，
申请(专利权)人：山东汇冠康博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37