一种用于单细胞和单微球共捕获的装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种用于单细胞和单微球共捕获的装置和方法，其中，所述的装置包括上部的样品腔、下部的液体腔以及安装在两者之间的微孔膜，所述液体腔底部设有液体管路，所述的微孔膜上设有至少一组微孔，每组微孔包含一大一小两个相互连接或相互靠近的微孔；尺寸较大的微孔用于捕获单细胞和单微球中较大的微粒，尺寸较小的微孔用于捕获单细胞和单微球中较小的微粒。利用本发明专利技术的装置进行单细胞和单微球的共捕获，可以实现高通量的捕获和分析，具有较高的捕获概率。

A device and method for CO capture of single cell and single microsphere

【技术实现步骤摘要】
一种用于单细胞和单微球共捕获的装置及方法
本专利技术属于单细胞分析领域，尤其是涉及一种用于单细胞和单微球共捕获的装置及方法。
技术介绍
细胞间存在异质性，即使是表型相同的细胞，也可能在基因表达、蛋白质含量、代谢物浓度等方面存在较大的个体差异，因此需要在单细胞水平上对细胞进行研究和分析。实现单细胞分析的一个重要前提是单细胞捕获，也就是将单个细胞从细胞群体中分离出来，将其置于独立环境，以避免细胞间的交叉污染。单细胞捕获涉及到多种技术，如介电操控技术、显微操纵技术等。微流控技术是其中之一，其具有精确操控微量液体(10-9至10-18升)的能力，可将反应缩小到微米尺度，因而也可以对微米尺度的细胞进行精确的操控。基于微流控技术的单细胞分析系统通常具有微量、高效、快速、高通量、微型化、集成化、自动化、便携化的特点。基于液滴的微流控技术属于微流控技术的范畴。与基于连续流的微流控技术不同的是，基于液滴的微流控技术通常利用特殊的微通道构型和不互溶载液对流体的切割、挤压等作用，而将连续的流体分割成非连续的液滴。这些液滴被与之不互溶的载液相隔离，因此每个液滴可以被看作一个独立的微反应器。由于液滴生成频率高，短时间内生成的大量液滴中的反应可被认为是平行反应，基于液滴的微流控技术易于实现高通量分析。此外，该技术还具有样品消耗低、操作自动化、分析速度快等特点，已被广泛应用于高通量筛选、单细胞分析、酶动力学测定等研究。基于液滴的微流控技术在单细胞分析中的应用，通常需要将单细胞和后续反应所需的试剂包裹到液滴微反应器中，然后这些单细胞液滴被置于同一环境中反应(被视为平行反应)。液滴微流控系统中最常用的单细胞包裹方法是大量平均法，就是将细胞悬液稀释到一定的浓度，并使之分散均匀，然后从中多次等体积地取样，或将其等体积地分割，生成单分散的液滴。悬液中的细胞被随机地分散到液滴中，而液滴中细胞的个数符合泊松分布。该方法快速而简单，然而单细胞包裹概率较低，最高只能达到36.8％，而且其中多细胞液滴(液滴中含有两个及以上的细胞)占了较大的比例。利用光镊、超声、压力、介电力和离心力来操纵和捕获单细胞的方法具有更强的主动性，因而往往可以达到较高的捕获率。例如，利用光镊控制细胞，将其转移到靠近水/油界面的位置，细胞可被新形成的液滴所包裹。有报道在单晶硅片刻蚀出通孔阵列，并以这些通孔为探针，在负压的作用下捕获细胞悬液中的细胞。通过控制负压的开关实现了单细胞捕获与释放，成功地将捕获到的单细胞转移到了PDMS微坑阵列中。对于单细胞分析与检测，微球能起到重要的辅助作用。例如，单个细胞分泌的待测蛋白含量极低，难以检测，如若微球表面修饰了可与该蛋白偶联的分子，则可以利用该微球对蛋白进行富集。对于单细胞测序，表面修饰了特定寡核苷酸的微球不仅可以捕获到待测细胞中的DNA或RNA片段，还能对细胞和该DNA/RNA片段进行标记，然后这些微球可直接进入测序仪进行上机测序。这类基于微球的单细胞测序方法与测序仪的兼容性好，而且简化了后续的操作，已得到了较为广泛的应用。而要将微球应用于基于液滴微流控技术的单细胞分析，尤其是单细胞测序，一般需要实现微球与细胞的共捕获，将单个微球与单个细胞包裹于同一液滴中。目前，常用的单微球和单细胞共捕获方法与单细胞捕获常用的大量平均法相似，是基于随机性的方法。单细胞捕获的随机性与单微球捕获的随机性相叠加，使共捕获方法所能达到的单细胞-单微球包裹概率明显低于仅单细胞的捕获概率。采用上述方法具有液滴生成速度快的优势，每小时生成液滴达几百万个，然而包裹概率很低，几百万个液滴中只有几千个液滴恰好包裹了一个微球和一个细胞。采取主动性更强的方法，引入压力、介电力等外界因素，很可能达到更高的捕获概率，为细胞与微球的共捕获提供新的思路，进而为单细胞测序及其他单细胞分析提供新方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于单细胞和单微球共捕获的装置及方法，为单细胞测序及其他单细胞分析提供一种高通量、高捕获概率的单细胞-单微球捕获技术。首先，本专利技术提供了一种用于单细胞和单微球共捕获的装置，包括上部的样品腔、下部的液体腔以及安装在两者之间的微孔膜，所述的微孔膜上设有至少一组微孔，每组微孔包含一大一小两个相互连接或相互靠近的微孔；其中，尺寸较大的微孔用于捕获单细胞和单微球中较大的微粒，尺寸较小的微孔用于捕获单细胞和单微球中较小的微粒。本专利技术中的微孔指的是单孔面积在1平方纳米至100平方毫米范围内的孔。为实现对微粒的捕获，微孔尺寸应小于其所要捕获的微粒的尺寸。微孔的结构主要有两种，第一种为：每组微孔包含一大一小两个相互连接的微孔。微孔可以有多种形状，作为优选，较大的微孔为圆形，较小的微孔为三角形，或梯形，或椭圆形，或多边形，或其他形状，每组微孔的整体形状近似于水滴形。两个微孔的形状主要视具体捕获对象和要求而定。无论采取何种形状微孔，每组微孔内大微孔与小微孔的中心间距应小于待捕获的尺寸较大的微粒的直径。只有这样，才能在第一轮捕获过程中，利用尺寸较大的微粒之间的空间排阻效应，避免尺寸较大的微粒被较小的微孔所捕获。第二种为：每组微孔包含一大一小两个相互靠近的微孔。两个微孔之间的中心间距小于待捕获的尺寸较大的微粒的直径。作为优选，两个微孔均为圆形、椭圆形、三角形、多边形或者其他形状。所述微孔所在的微孔膜是在无机材料(如硅、氮化硅、金属、石英、玻璃)，或有机材料，或高分子聚合物材料(如环氧SU-8树脂)的基材上加工出微孔。所述的样品腔和液体腔，可以有多种结构模式，如敞开式的容器型结构，或微流控芯片上的流动通道结构。所述液体腔底部可为敞开结构，也可设有液体管路。本专利技术还提供了一种单细胞和单微球共捕获方法，采用上述用于单细胞和单微球共捕获的装置，包括以下步骤：(1)根据待捕获的细胞和微球的尺寸，选择对应的微孔膜安装在样品腔和液体腔之间，同时确定捕获的顺序；(2)在样品腔或液体腔或两腔中加入液体，使微孔膜处于液体环境；(3)打开驱动源，为微孔膜的一侧或者两侧提供驱动力；(4)在样品腔中加入微球样品和细胞样品中尺寸较大的样品，在驱动力的作下，利用微孔膜上的尺寸较大的微孔对该样品进行捕获；(5)去除样品腔内多余的微球或细胞；(6)在样品腔中加入微球样品和细胞样品中尺寸较小的样品，在驱动力的作下，利用微孔膜上的尺寸较小的微孔对该样品进行捕获；(7)去除样品腔内多余的细胞或微球，关闭驱动源，完成共捕获。利用上述方法实施单细胞和单微球的共捕获时，分别地、先后地对微球和细胞进行捕获。先捕获微球再捕获细胞，或先捕获细胞再捕获微球。在捕获微球或细胞时，微球或细胞处于液体中；为了保证液体环境，微孔膜的一侧的样品腔内加入含有微球和细胞的液体；微孔膜另一侧的液体腔用于承载通过微孔的液体。为了能够对微孔膜上的捕获状况进行实时地观察，以便准确地判断捕获进程，步骤(1)中，在样品腔上方设置显微镜，并用照相机将显微镜捕捉到的图像实时地反映到计算机屏幕上。步骤(3)中，所述的驱动力包括但不限于流本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于单细胞和单微球共捕获的装置，其特征在于，包括上部的样品腔、下部的液体腔以及安装在两者之间的微孔膜，所述的微孔膜上设有至少一组微孔，每组微孔包含一大一小两个相互连接或相互靠近的微孔；其中，尺寸较大的微孔用于捕获单细胞和单微球中较大的微粒，尺寸较小的微孔用于捕获单细胞和单微球中较小的微粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于单细胞和单微球共捕获的装置，其特征在于，包括上部的样品腔、下部的液体腔以及安装在两者之间的微孔膜，所述的微孔膜上设有至少一组微孔，每组微孔包含一大一小两个相互连接或相互靠近的微孔；其中，尺寸较大的微孔用于捕获单细胞和单微球中较大的微粒，尺寸较小的微孔用于捕获单细胞和单微球中较小的微粒。


2.根据权利要求1所述的用于单细胞和单微球共捕获的装置，其特征在于，每组微孔包含一大一小两个相互连接的微孔，较大的微孔为圆形，较小的微孔为三角形、梯形、椭圆形或多边形，每组微孔的整体形状近似于水滴形；每组微孔内大微孔与小微孔的中心间距小于待捕获的尺寸较大的微粒的直径。


3.根据权利要求1所述的用于单细胞和单微球共捕获的装置，其特征在于，每组微孔包含一大一小两个相互靠近的微孔，且两个微孔之间的中心间距小于待捕获的尺寸较大的微粒的直径；两个微孔分别为圆形、椭圆形、三角形或多边形。


4.根据权利要求1所述的用于单细胞和单微球共捕获的装置，其特征在于，所述微孔膜是在无机材料、有机材料或高分子聚合物材料的基材上加工而成；微孔的单孔面积在1平方纳米至100平方毫米范围内，微孔尺寸小于其所要捕获的微粒的尺寸。


5.一种单细胞和单微球共捕获方法，其特征在于，采用权利要求1～4任一所述的用于单细胞和单微球共捕获的装置，包括以下步骤：
(1)根据待捕获的细胞和微球的尺寸，选择对应的微孔膜安装在样品腔和液体腔之间，同时确定捕获的顺序；
(2)在样品腔或液体腔或两腔中加入液体，使微孔膜处于液体环境；
(3)打开驱动源，为微孔膜的一侧或者两侧提供驱动力；
(4)在样品腔中加入微球样品和细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：董芝，方群，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33