一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法及应用，属于分子细胞生物学和生物化学技术领域。本发明专利技术通过构建维生素K循环小分子抑制剂筛选体系(即双报告基因细胞体系)，可以快速对药物小分子库进行高通量筛选，得到靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；进一步通过检测筛选出的小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制作用，可以得到特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物。采用该方法，本发明专利技术首次筛选到一些结构不同于香豆素类的衍生物和苯茚二酮类的衍生物的化合物，它们能特异性抑制VKOR蛋白活性，具有开发为灭鼠药和抗凝药物的潜在应用价值，是开发灭鼠药和抗凝药物的先导化合物。

Screening method and application of a small molecular compound targeting to inhibit vitamin K epoxide reductase

【技术实现步骤摘要】
一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法及应用
本专利技术涉及一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法及应用，属于分子细胞生物学和生物化学

技术介绍
维生素K在血液正常凝固中发挥重要作用，主要用于防止新生婴儿出血疾病、预防内出血以及维生素K拮抗剂的解毒剂。维生素K通过调节一些凝血因子(如凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ)的翻译后修饰参与凝血(如图1所示)。维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基γ羧基化修饰是其发挥凝血功能的必要条件。维生素K在这一翻译后修饰过程中发挥核心作用，并以三种形式在体内循环，分别是维生素K环氧化物(KO)、维生素K(K)和二氢维生素K(KH2)。目前已知两个酶在维生素K循环中发挥作用。其中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)利用KH2为辅因子，对维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基进行γ羧基化修饰，同时把KH2转化成KO。为了使GGCX的催化反应可以持续进行，KO必须被还原成KH2，而这一反应主要是由具有KO还原酶活性和K还原酶活性的维生素K环本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物/n将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；/n所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n2)筛选特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物/n对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物
将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；
所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
2)筛选特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物
对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物。


2.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述双报告基因细胞体系的宿主细胞为人胚肾细胞293Trex。


3.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述报告基因为甲虫荧光素酶报告基因，甲虫荧光素酶报告基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


5.据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述双报告基因细胞体系培养液中维生素K的浓度为1～20μmol/L。


6.据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤2)中，VKOR蛋白活性抑制测定的方法如下：
将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K环氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈国民，刘浩，沈滟，刘红丽，曹青，高蒙，李三强，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41