检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了生物化学相关技术领域的检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒及其使用方法，检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒，包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、清洗液和发光底物；本发明专利技术采用以磁微粒子作为免疫反应的固相，利用化学发光酶联免疫分析方法与化学发光类测定仪器配合，用于测定人体血清中的幽门螺旋杆菌抗体含量，并且可以在全自动化学发光仪上同时测定多个样本，实现幽门螺旋杆菌抗体的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率有了较大的提高。

【技术实现步骤摘要】
检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及生物化学相关
，特别涉及检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
幽门螺旋杆菌是一种弯曲、螺旋形或S形的革兰染色阴性微需氧杆菌。1979年澳大利亚学者Warren及Marshall首次从胃黏膜分离培养出幽门螺杆菌，随后发现消化性溃疡和慢性胃炎的首要病因是幽门螺旋杆菌。幽门螺旋杆菌属于临床上常见的革兰氏阴性杆菌，主要分布在机体的胃部、十二指肠等区域中，可能造成胃粘膜慢性炎症，严重者甚至出现胃及十二指肠溃疡或者胃癌，直接威胁患者生命安全，受到医疗界重点关注。幽门螺旋杆菌能够轻易穿透胃粘膜，从而生长于胃上皮细胞，同时促进大量尿素酶产生，将其分解后可在菌体周边形成碱性的“氨云”，以此抵抗胃内酸性环境，从而避免被胃酸杀灭。幽门螺旋杆菌是目前公认的慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的致病因素之一，已被世界卫生组织列为I类致癌源。幽门螺杆菌(HP)感染率极高，在发达国家占成年人的30～50％，发展中国家为40～80％，中国流行学调查结果为40～90％平均为59％。幽门螺旋杆菌中包括CanA、Urease及VacA三种分型，其中CagA并无细胞毒性作用，可能与VacA转录能力存在密切相关性；而VacA能够改变上皮细胞空泡样，并使其受损、坏死甚至发生溃疡。目前已知的幽门螺旋杆菌抗体测定方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、胶乳增强比浊法等。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。胶乳增强免疫比浊法操作简单、快速，但是灵敏度低、低值重复性差。
技术实现思路
针对现有技术存在以上的技术问题，本专利技术提供检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒及其使用方法。基于以下技术原理：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的HP抗原与碱性磷酸酶(AP)标记的HP抗原和样本、校准品或质控品中的HP抗体结合形成“三明治”复合物。随后加入连有抗FITC抗体的磁微粒，通过抗FITC抗体与FITC的特异性结合使抗原抗体免疫复合物结合在磁微粒上。在外加磁场的作用下，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离，清洗复合物后，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时发出光子，形成发光反应，即可使用化学发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内，发光强度与样本中的HP抗体的含量成正比，使用改良的四参数Logistic方程拟合可计算出样本中HP抗体浓度。本专利技术的技术方案为：检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒，包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、清洗液和发光底物；所述抗试剂A为包括异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体连接物的BSA缓冲溶液；所述抗试剂A通过包括以下步骤的操作制备而成：Sa1：用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液；Sa2：向幽门螺旋杆菌抗体中加入所述幽门螺旋杆菌抗体质量1.1～1.5倍的所述异硫氰酸荧光素溶液并充分混合；Sa3：用pH为8～9的碳酸盐缓冲液调节pH平衡，再用凝胶层析分离纯化制得异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体包被抗体；所述抗试剂B为包括碱性磷酸酶标记的幽门螺旋杆菌抗原连接物的BSA的缓冲溶液；所述抗试剂B通过包括以下步骤的操作制备而成：Sb1：用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液；Sb2：用幽门螺旋杆菌抗原和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化，然后按照摩尔比为碱性磷酸酶：幽门螺旋杆菌抗原为1:1～1:3的比例，在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应；Sb3：使用pH为8～9的Tris缓冲液调节pH平衡，再用凝胶柱分离纯化制得碱性磷酸酶标记的幽门螺旋杆菌抗原连接物；Sb4：筛选出效果最优的分子片段进行测试；所述磁微粒试剂通过包括抗异硫氰酸荧光素羊抗FITC与羧基磁珠偶联物的BSA缓冲溶液；所述校准品和所述质控品均通过包括以下步骤的操作制备而成：在1L的含BSA缓冲液中加入0.01～0.05g的四环素和0.1～0.5g的硫酸新霉素，然后加入幽门螺旋杆菌抗体并充分溶解；所述清洗液通过将150～170gNaCl、3～5gKCl、24～24.4g三羟甲基氨基甲烷、0.8～1.2mL吐温20溶于900ml双蒸水中，再用HCl调整至pH7.2～7.6，最后用双蒸水定容至1000ml制备而成；所述发光底物通过将ALPS溶解于缓冲液中制备而成。进一步的，所述抗试剂缓冲液通过包括以下步骤的操作制备而成：准确称取如下组分：10～20gNa2PO3H·12H2O、1～2gNaPO3H2·12H2O、3～10g新生牛血清；将称得的各组分加入1L的纯化水中，充分搅拌至完全溶解；调节pH值为5～6即得。进一步的，调节pH值的试剂为4M的HCl。进一步的，Sa2在避光条件下操作。进一步的，所述校准品和所述质控品均经过0.22μm滤膜处理。进一步的，所述磁微粒试剂通过包括以下步骤的操作制备而成：Sc1：将充分混匀后的羧基磁珠浓缩液在磁场内放置15～20min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向所述羧基磁珠中加入所述羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min后在磁场内放置15～20min再吸去上清；重复清洗羧基磁珠1～3遍；最后将羧基磁珠混合液定容到10～50mg/mL，制得羧基磁珠溶液；Sc2：向所述羧基磁珠溶液中加入所述羧基磁珠溶液质量0.8～1.2％的抗异硫氰酸荧光素羊抗FITC，在2～8℃内保持混匀状态反应16～20h；Sc3：将Sc2制得的溶液在磁场中放置12～18min，待所述羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液洗1～3遍，随后定容至8～12mg/mL，2～8℃保存。进一步的，所述磁微粒缓冲液通过将12.12～15.26mg的Tris、5.82～8.58mg的NaCl和50～60g的甲基纤维醚加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解制备而成。上述任一项所述的检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：Sd1：取三支试管分别加30μL所述校准品、30μL所述质控品、30μL待测样本；Sd2：向每支试管中加入30μL抗试剂A和30μL抗试剂B，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置于37℃下水浴5min；Sd3：再向每支试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5min；Sd4：将所有试管在磁分离器上沉淀3min，缓慢地倒转所述试管和所述磁分离器，倒出上清液；把倒转的所述试管连同所述磁分离器一起，放在滤纸上，拍击所述磁分离器底部除去粘在管壁上的所有液滴；Sd5：向每支试管中加入300μL所述清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒，其特征在于：包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、清洗液和发光底物；/n所述抗试剂A为包括异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体连接物的BSA缓冲溶液；所述抗试剂A通过包括以下步骤的操作制备而成：/nSa1：用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液；/nSa2：向幽门螺旋杆菌抗体中加入所述幽门螺旋杆菌抗体质量1.1～1.5倍的所述异硫氰酸荧光素溶液并充分混合；/nSa3：用pH为8～9的碳酸盐缓冲液调节pH平衡，再用凝胶层析分离纯化制得异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体包被抗体；/n所述抗试剂B为包括碱性磷酸酶标记的幽门螺旋杆菌抗原连接物的BSA的缓冲溶液；所述抗试剂B通过包括以下步骤的操作制备而成：/nSb1：用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液；/nSb2：用幽门螺旋杆菌抗原和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化，然后按照摩尔比为碱性磷酸酶：幽门螺旋杆菌抗原为1:1～1:3的比例，在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应；/nSb3：使用pH为8～9的Tris缓冲液调节pH平衡，再用凝胶柱分离纯化制得碱性磷酸酶标记的幽门螺旋杆菌抗原连接物；/n所述磁微粒试剂通过包括抗异硫氰酸荧光素羊抗FITC与羧基磁珠偶联物的BSA缓冲溶液；/n所述校准品和所述质控品均通过包括以下步骤的操作制备而成：在1L的含BSA缓冲液中加入0.01～0.05g的四环素和0.1～0.5g的硫酸新霉素，然后加入幽门螺旋杆菌抗体并充分溶解；/n所述清洗液通过将150～170gNaCl、3～5gKCl、24～24.4g三羟甲基氨基甲烷、0.8～1.2mL吐温20溶于900ml双蒸水中，再用HCl调整至pH7.2～7.6，最后用双蒸水定容至1000ml制备而成；/n所述发光底物通过将ALPS溶解于缓冲液中制备而成。/n...

【技术特征摘要】
1.检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒，其特征在于：包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、清洗液和发光底物；
所述抗试剂A为包括异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体连接物的BSA缓冲溶液；所述抗试剂A通过包括以下步骤的操作制备而成：
Sa1：用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液；
Sa2：向幽门螺旋杆菌抗体中加入所述幽门螺旋杆菌抗体质量1.1～1.5倍的所述异硫氰酸荧光素溶液并充分混合；
Sa3：用pH为8～9的碳酸盐缓冲液调节pH平衡，再用凝胶层析分离纯化制得异硫氰酸荧光素标记的幽门螺旋杆菌抗体包被抗体；
所述抗试剂B为包括碱性磷酸酶标记的幽门螺旋杆菌抗原连接物的BSA的缓冲溶液；所述抗试剂B通过包括以下步骤的操作制备而成：
Sb1：用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液；
Sb2：用幽门螺旋杆菌抗原和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化，然后按照摩尔比为碱性磷酸酶：幽门螺旋杆菌抗原为1:1～1:3的比例，在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应；
Sb3：使用pH为8～9的Tris缓冲液调节pH平衡，再用凝胶柱分离纯化制得碱性磷酸酶标记的幽门螺旋杆菌抗原连接物；
所述磁微粒试剂通过包括抗异硫氰酸荧光素羊抗FITC与羧基磁珠偶联物的BSA缓冲溶液；
所述校准品和所述质控品均通过包括以下步骤的操作制备而成：在1L的含BSA缓冲液中加入0.01～0.05g的四环素和0.1～0.5g的硫酸新霉素，然后加入幽门螺旋杆菌抗体并充分溶解；
所述清洗液通过将150～170gNaCl、3～5gKCl、24～24.4g三羟甲基氨基甲烷、0.8～1.2mL吐温20溶于900ml双蒸水中，再用HCl调整至pH7.2～7.6，最后用双蒸水定容至1000ml制备而成；
所述发光底物通过将ALPS溶解于缓冲液中制备而成。


2.根据权利要求1所述的检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒，其特征在于：所述抗试剂缓冲液通过包括以下步骤的操作制备而成：准确称取如下组分：10～20gNa2PO3H·12H2O、1～2gNaPO3H2·12H2O、3～10g新生牛血清；将称得的各组分加入1L的纯化水中，充分搅拌至完全溶解；调节pH值为5～6即得。


3.根据权利要求2所述的检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒，其特征在于：调节pH值的试剂为4M的HCl。


4.根据权利要求1所述的检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒，其特征在于：Sa2在避光条件下操作。


5.根据权利要求1所述的检测血清中幽门螺旋杆菌抗体含量的试剂盒，其特征在于：所述校准品和所述质控品均经过0.22μm滤膜处理。

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【专利技术属性】
技术研发人员：丁建华，刘振世，顾丽，薛婷，王琳，庞吉丰，
申请(专利权)人：江苏泽成生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32