本发明专利技术公开了一种细胞冻存液及其制备方法和应用。所述的干细胞冻存液包含以下成分：水，基础培养基，多聚L‑赖氨酸，丁二酸酐，右旋糖苷40，维生素E，维生素C等。本发明专利技术创新性地采用羧基化多聚L‑赖氨酸(CPLL)作为有效抗冻组分。CPLL由多聚L‑赖氨酸和丁二酸酐在温水体系中反应而来。本发明专利技术的干细胞冻存液不含有血清和DMSO，成分明确安全，批间稳定性高，有效保持细胞在冻存和复苏后的高活率，细胞形态正常，后续增殖能力和分化潜能不受影响。该冻存液非常适合在临床上用于替代含血清和DMSO的冻存液。
A cell cryopreservation solution and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种细胞冻存液及其制备方法和应用
本专利技术属于生物试剂领域，涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞冻存是指利用专门的冻存技术将细胞置于超低温长期保存，使细胞脱离生长状态，保持细胞特性并且在需要的时候可以通过专门的复苏技术将细胞复苏用于后续科研实验、工业生产或临床应用。目前，实验室常用的细胞冻存液或商品化的细胞冻存液中通常需要加入二甲基亚砜(DMSO)和血清。二甲基亚砜(DMSO)可以在低温冻存过程中有效地减少细胞内冰晶的形成、维持细胞内外溶质平衡，减少渗透压的改变、细胞结构变化等导致的细胞损伤，是目前最常用的细胞冻存液的有效成分。虽然，通常认为当浓度小于10％时，二甲基亚砜(DMSO)的毒性作用很小，但是在回输细胞的治疗过程中，冻存细胞中残留的二甲基亚砜(DMSO)依旧会产生许多的副作用，例如神经毒性、恶心呕吐、心率失常等。同时二甲基亚砜(DMSO)会抑制细胞增殖，并且被发现对多种细胞具有毒性，例如成牙本质细胞、星形细胞、干细胞等。而血清作为一种成分尚不明确的动物源物质，具有一定的批次间差异，影响细胞冻存液效果的稳定性，并且在临床使用中容易导致过敏。因此，细胞冻存领域一直需要一种高效、安全、稳定的细胞冻存液，也要求该冻存液可以对一些常用于临床的细胞进行冻存，比如免疫细胞细胞、间充质干细胞等。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种细胞冻存液的制备方法。本专利技术的另一目的是提供该方法制备的到的细胞冻存液。本专利技术的又一目的是提供该细胞冻存液的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种细胞冻存液的制备方法，包含以下步骤：(1)将10％～80％多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为10～50g：100mL；(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2～3；(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：20～500mg/100ml，1，2丙二醇：0.5～5mol/L，维生素E：10～50mg/100ml,维生素C：20～200mg/100ml。(4)将上述步骤配好的溶液PH调整为7.0后经0.22微米滤膜过滤得所述的细胞冻存液。其中，步骤(1)中所述的多聚L-赖氨酸水溶液的浓度优选20～30g/100mL。步骤(1)中所述的丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比优选10～20g:100ml。步骤(2)中所述的反应液与所述的DMEM基础培养基的体积比优选1:2.3。步骤(3)中各物质的终浓度优选：右旋糖苷40：280～350mg/100ml，1，2丙二醇：1～2mol/L，维生素E：20～25mg/100ml,维生素C：80～130mg/100ml。步骤(3)中各物质的终浓度为：右旋糖苷40：280～300mg/100ml，1，2丙二醇：1～1.5mol/L，维生素E：20～22mg/100ml,维生素C：90～105mg/100ml。步骤(3)中各物质的终浓度更进一步优选：右旋糖苷40：300mg/100ml，1，2丙二醇：1.5mol/L，维生素E：20mg/100ml,维生素C：100mg/100ml。按照本专利技术所述的制备方法制备得到的细胞冻存液。本专利技术所述的细胞冻存液在间充质干细胞或者其他类型细胞的低温冻存中的应用。有益效果本专利技术公开了一种细胞冻存液，可用于间充质干细胞或者其他类型细胞的低温冻存。所述的干细胞冻存液包含以下成分：水，基础培养基，多聚L-赖氨酸，丁二酸酐，右旋糖苷40，维生素E，维生素C等。本专利技术创新性地采用羧基化多聚L-赖氨酸(CPLL)作为有效抗冻组分。CPLL由多聚L-赖氨酸和丁二酸酐在温水体系中反应而来。CPLL侧链氨基对细胞膜的高亲和力有助于维持细胞膜的完整性，同时CPLL对水具有高亲和力，也有助于在冷冻过程中将细胞内水分离到细胞周围,抑制冰晶生长和重结晶，从而保护了细胞免受冷冻损伤。本专利技术的干细胞冻存液不含有血清和DMSO，成分明确安全，批间稳定性高，有效保持细胞在冻存和复苏后的高活率，细胞形态正常，后续增殖能力和分化潜能不受影响。该冻存液非常适合在临床上用于替代含血清和DMSO的冻存液。附图说明图1.实施例1细胞冷冻液冻存的细胞复苏后4天细胞形态图2.实施例2细胞冷冻液冻存的细胞复苏后4天细胞形态图3.实施例3细胞冷冻液冻存的细胞复苏后4天细胞形态图4.实施例1冻存前细胞形态具体实施方式实施例1：(1)将25g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为13g：100mL；(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的DMEM基础培养基的体积比为1:2.3；(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：300mg/100ml，1，2丙二醇：1.5mol/L，维生素E：20mg/100ml,维生素C：100mg/100ml。(4)将上述步骤配好的溶液PH调整为7.0后经0.22微米滤膜过滤得所述的细胞冻存液。实施例2：(1)将22g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为13g：100mL；(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2.3；(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：300mg/100ml，1，2丙二醇：1.5mol/L，维生素E：20mg/100ml,维生素C：100mg/100ml。实施例3：(1)将28g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为13g：100mL；(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2.3；(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：300mg/100ml，1，2丙二醇：1.5mol/L，维生素E：20mg/100ml,维生素C：100mg/100ml。实施例4(1)将20g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞冻存液的制备方法，其特征在于包含以下步骤：/n(1)将10～80g/100mL多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为10～50g：100mL；/n(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2～3；/n(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：20～500mg/100ml，1，2丙二醇：0.5～5mol/L，维生素E：10～50mg/100ml,维生素C：20～200mg/100ml。/n(4)将上述步骤配好的溶液PH调整为7.0后经0.22微米滤膜过滤得所述的细胞冻存液。/n
【技术特征摘要】
1.一种细胞冻存液的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)将10～80g/100mL多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为10～50g：100mL；
(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2～3；
(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：20～500mg/100ml，1，2丙二醇：0.5～5mol/L，维生素E：10～50mg/100ml,维生素C：20～200mg/100ml。
(4)将上述步骤配好的溶液PH调整为7.0后经0.22微米滤膜过滤得所述的细胞冻存液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的多聚L-赖氨酸水溶液的浓度为20～30g/100mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为10～20g:100ml。
4.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅子文，陈瑶，张文锦，李一佳，
申请(专利权)人：杭州清大科瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。