一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法，包括以下步骤：步骤1）、将30.2～31.2gTris、15.9～16.9g柠檬酸、19.5～20.5g果糖、0.3～0.4g青霉素钠、0.6～0.7g链霉素硫酸盐溶解于1000mL灭菌的超纯水中，得到基础稀释液；步骤2）、当取95mL基础稀释液，向95mL基础稀释液中添加5mL的卵黄，得到第一稀释液；当取85mL基础稀释液，向85mL基础稀释液中添加15mL的卵黄，得到第二稀释液；当取80mL基础稀释液，向80mL基础稀释液中添加20mL的卵黄，得到第三稀释液；将第一稀释液、第二稀释液、第三稀释液放入冰箱使其充分溶解，然后10000r/min、4℃条件下离心20min，离心后取出上清液，即得到浓度为5%卵黄稀释液、浓度为15%卵黄稀释液、浓度为20%卵黄稀释液。通过发明专利技术提供的稀释液，提高了精液保存效果。

A preparation method of diluent for normal temperature preservation of Sheep Semen

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法
本专利技术涉及一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法，属于绵羊繁殖

技术介绍
人工受精技术是家畜繁殖中的一项基本技术，能够充分地利用优良种公畜的精液，是一种提高家畜生殖效率和生产力的重要手段。人工授精技术可以降低养殖成本，防止疾病的传播，实现规模化的饲养和管理。精液保存则是人工授精技术中的关键环节。精液保存通常分为常温保存、低温保存和冷冻保存。在实际生产中，精液保存大多采用常温保存，其具有处理操作过程简单、适合推广应用、无需特殊的控温及制冷设备等优点，具有实际的应用价值。现有的绵羊精液常温保存稀释液配方其精子活力在保存96小时开始快速下降，严重影响了精液品质。精液低温保存和超低温冷冻保存通常都添加卵黄，在猪、狗和兔等物种的精液稀释液中也都有添加应用。不同的卵黄如鸡蛋、鸭蛋等在不同哺乳动物的精液保存中也都有应用。卵黄可以发挥抗冻保护剂和提供能量两大作用。Phihphs最早把卵黄作为抗冻保护剂添加到稀释液中，有效降低了精子细胞在降温过程中受到的损伤，取得了较好的效果。卵黄中的低密度脂蛋白聚集在精子膜的表面，减少了精子的冷休克，在精液冷冻保存中发挥了关键作用。除此之外，卵黄可以调节稀释液中的渗透压和电解质的浓度，使其环境适宜精液保存，同时降低了对精子膜的影响，延长了有效存活时间和总存活时间。卵黄在精液低温保存和冷冻保存中既然可以发挥一定的作用，且在绵羊精液常温保存上的研究鲜有报道。为此，有必要通过研究卵黄的作用来专利技术可以提高绵羊精液常温保存品质的稀释液配方，来提高人工受精技术的效率，降低精液保存的成本，满足实际生产的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有问题，提供一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法，提供卵黄在绵羊精液常温保存的稀释液配方中的应用效果，用于解决现有技术中，绵羊精液保存后期精子活力快速下降的问题，使其延长精液的保存时间，根据不同的时间要求，选择不同效果的稀释液配方。本专利技术的目的是这样实现的，一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法，其特征是，包括以下步骤：步骤1)、将30.2～31.2gTris、15.9～16.9g柠檬酸、19.5～20.5g果糖、0.3～0.4g青霉素钠、0.6～0.7g链霉素硫酸盐溶解于1000mL灭菌的超纯水中，得到基础稀释液；步骤2)、当取95mL经步骤1)配制的基础稀释液，向95mL基础稀释液中添加5mL的卵黄，得到第一稀释液，然后将第一稀释液放入冰箱使其充分溶解，然后10000r/min、4℃条件下离心20min，离心后取出上清液，即得到卵黄浓度为5％的卵黄稀释液；当取85mL经步骤1)配制的基础稀释液，向85mL基础稀释液中添加15mL的卵黄，得到第二稀释液，然后将第二稀释液放入冰箱使其充分溶解，然后10000r/min、4℃条件下离心20min，离心后取出上清液，即得到卵黄浓度为15％的卵黄稀释液；当取80mL经步骤1)配制的基础稀释液，向80mL基础稀释液中添加20mL的卵黄，得到第三稀释液，然后将第三稀释液放入冰箱使其充分溶解，然后10000r/min、4℃条件下离心20min，离心后取出上清液，即得到卵黄浓度为20％的卵黄稀释液；卵黄浓度为5％的卵黄稀释液、卵黄浓度为15％的卵黄稀释液、卵黄浓度为20％的卵黄稀释液均为绵羊精液常温保存的稀释液。步骤1)中，首先将30.2～31.2gTris、15.9～16.9g柠檬酸、19.5～20.5g果糖、0.3～0.4g青霉素钠、0.6～0.7g链霉素硫酸盐充分溶解于1000mL灭菌的超纯水中，然后使用0.22μm滤膜进行过滤除菌，过滤除菌后添加0.3～0.4g青霉素钠、0.6～0.7g链霉素硫酸盐，使其充分溶解，得到基础稀释液。步骤1)中基础稀释液由30.7gTris、16.4g柠檬酸、20g果糖、0.3118g青霉素钠、0.6944g链霉素硫酸盐溶解于1000mL灭菌超纯水构成。本专利技术方法先进科学，通过专利技术，提供的一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法，制备出来的绵羊精液常温保存的稀释液，包括浓度为5％的卵黄稀释液、浓度为15％的卵黄稀释液、浓度为20％的卵黄稀释液三种，如果在保存前6天内进行人工授精，则稀释液一，即卵黄添加量为5％效果最好。如果在保存6～9天内进行人工授精，则稀释液二，即卵黄添加量为15％效果最好。如果在保存9～12天内进行人工授精，则稀释液三，即卵黄添加量为20％效果最好。采集精液结束后，把绵羊的精液稀释10倍，把离心管插入浮板中，放置在盛有25℃温水的烧杯中，再放于16℃缓慢降温以进行常温保存，每隔一段时间轻轻摇晃保存精液的离心管，防止精子沉淀。绵羊精液稀释后，采用计算机精子辅助分析仪(CASA)对绵羊精液保存期间的活率、活力以及一些设定的运动参数进行检测。通过本专利技术提供的绵羊精液常温保存的稀释液配方，本专利技术使用五种不同浓度的卵黄稀释液对绵羊精液进行常温保存，采用计算机精子辅助分析仪(CASA)对精液保存期间的活率、活力以及一些运动参数进行检测，本专利技术通过添加不同浓度卵黄，提高了精液的保存效果，在精液保存期间，添加卵黄组的活率、活力缓慢平稳下降，延长了有效存活时间，显著延长了总存活时间。如果在保存前6天内进行人工授精，则稀释液一即卵黄添加量为5％效果最好。如果在保存6～9天内进行人工授精，则稀释液二即卵黄添加量为15％效果最好。如果在保存9～12天内进行人工授精，则稀释液三卵黄添加量为20％效果最好。本专利技术旨在客观的评价并筛选出可以提高绵羊精液常温保存效果的稀释液配方，以期为绵羊精液保存技术在生产中的推广应用提供参考，进一步提高绵羊的养殖规模。本专利技术的稀释液配方，添加不同浓度卵黄，提高了精液的保存效果，在精液保存期间，添加卵黄组的活率、活力缓慢平稳下降，延长了有效存活时间，显著延长了总存活时间。且本专利技术得到稀释液配方成本低廉，配置工序简便，不需要昂贵的设备进行保存，一定程度上降低了养殖成本，同时的到了很好的保存效果，对绵羊养殖规模的发展有着深远的影响，对实际应用有着深远的影响。本稀释液配方使用后，可以减少精液低温保存和超低温保存时繁琐的准备工作，可以去掉解冻的操作过程，大大减少了操作时间，同时可以减少精液保存设备如冰箱、液氮罐、程控降温仪等昂贵设备的购买，同时也不需要专业的技术人员进行操作，大大降低了养殖成本。若使用该配方对精液进行常温保存，可以达到很好的保存效果，能够避免超低温冷冻保存对精子结构的损伤，可以提高人工授精技术的效率，提高受胎率，产生一定的经济效益，在实际生产和试验中都具有深远的应用前景。附图说明图1为不同稀释液对保存精子活率的影响图(5％的卵黄添加量、15％的卵黄添加量、20％的卵黄添加量的三种稀释液为本专利技术提供的稀释液配方)；图2为不同稀释液对保存精子活力的影响图(5％的卵黄添加量、15％的卵黄添加量、20％的卵黄添加量的三种稀释液为本专利技术提供的稀释液配方)。具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法，其特征是，包括以下步骤：/n步骤1）、将30.2～31.2gTris、15.9～16.9g柠檬酸、19.5～20.5g果糖、0.3～0.4g青霉素钠、0.6～0.7g链霉素硫酸盐溶解于1000mL灭菌的超纯水中，得到基础稀释液；/n步骤2）、当取95mL经步骤1）配制的基础稀释液，向95mL基础稀释液中添加5mL的卵黄，得到第一稀释液，然后将第一稀释液放入冰箱使其充分溶解，然后10000r/min、4℃条件下离心20min，离心后取出上清液，即得到卵黄浓度为5%的卵黄稀释液；/n当取85mL经步骤1）配制的基础稀释液，向85mL基础稀释液中添加15mL的卵黄，得到第二稀释液，然后将第二稀释液放入冰箱使其充分溶解，然后10000r/min、4℃条件下离心20min，离心后取出上清液，即得到卵黄浓度为15%的卵黄稀释液；/n当取80mL经步骤1）配制的基础稀释液，向80mL基础稀释液中添加20mL的卵黄，得到第三稀释液，然后将第三稀释液放入冰箱使其充分溶解，然后10000r/min、4℃条件下离心20min，离心后取出上清液，即得到卵黄浓度为20%的卵黄稀释液；/n卵黄浓度为5%的卵黄稀释液、卵黄浓度为15%的卵黄稀释液、卵黄浓度为20%的卵黄稀释液均为绵羊精液常温保存的稀释液。/n...

【技术特征摘要】
1.一种绵羊精液常温保存的稀释液的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1）、将30.2～31.2gTris、15.9～16.9g柠檬酸、19.5～20.5g果糖、0.3～0.4g青霉素钠、0.6～0.7g链霉素硫酸盐溶解于1000mL灭菌的超纯水中，得到基础稀释液；
步骤2）、当取95mL经步骤1）配制的基础稀释液，向95mL基础稀释液中添加5mL的卵黄，得到第一稀释液，然后将第一稀释液放入冰箱使其充分溶解，然后10000r/min、4℃条件下离心20min，离心后取出上清液，即得到卵黄浓度为5%的卵黄稀释液；
当取85mL经步骤1）配制的基础稀释液，向85mL基础稀释液中添加15mL的卵黄，得到第二稀释液，然后将第二稀释液放入冰箱使其充分溶解，然后10000r/min、4℃条件下离心20min，离心后取出上清液，即得到卵黄浓度为15%的卵黄稀释液；
当取80mL经步骤1）配制的基础稀释液，向80mL基础稀释液中添加20mL的卵黄，得到第三稀释液，然后将第三稀释液放入冰箱使其充分...

【专利技术属性】
技术研发人员：李拥军，张柳明，冯云奎，马金亮，王健，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32