用部分立体限定的寡核苷酸子文库鉴定反义寡核苷酸改进的立体限定硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法技术

本发明专利技术涉及使用部分立体限定的寡核苷酸子文库，鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法。这些方法允许高效鉴定具有改进特性的立体限定的变体，如增强的体外或体内活性、增强的功效、增强的比活性、降低的毒性、改变的生物分布、增强的细胞或组织摄取和/或增强的靶特异性(脱靶效应减少)。本文公开了多个平行的文库筛选方案，其中优化立体限定的硫代磷酸酯连接的核苷的多个排他性或重叠性短子区域或基序，以鉴定增强的子文库，并且随后合并来自每个选定(改进的)子文库的立体限定的核苷间键样式，以产生增强的立体限定的化合物。

Identification of antisense oligonucleotides by a partial stereospecific oligonucleotide Library

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用部分立体限定的寡核苷酸子文库鉴定反义寡核苷酸改进的立体限定硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法专利
本专利技术涉及使用部分立体限定的寡核苷酸子文库，鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法。这些方法允许高效鉴定具有改进特性的立体限定的变体，如增强的体外或体内活性、增强的功效、增强的比活性、降低的毒性、改变的生物分布、增强的细胞或组织摄取和/或增强的靶特异性(脱靶效应减少)。
技术介绍
最近已经确立，立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸变体的产生可以用来创造卓越的药理学多样性，并且如同小分子药物发现范式一样，立体非对映异构体之间看似微小的结构性差异可以产生药理学性能(包括效价、毒性、功效、细胞摄取和生物分布)重大差异的化合物。在这个方面，传统的硫代磷酸酯寡核苷酸，16个核苷酸长度含有多达215个不同的非对映异构体，可能超过32,000种药理学不同的化合物。存在从这类混合物鉴定药理学最佳化合物的可观潜力，一种可以产生治疗潜力远大于标准立体无规硫代磷酸酯的化合物的可能性。先前，研究者已经致力于鉴定立体限定的基序，一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：/na.向母体寡核苷酸提供限定的序列和核苷修饰样式；/nb.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留母体寡核苷酸的限定的序列和核苷修饰样式，/n其中/n(i)文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸非对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员包含立体限定的核苷间基序区域，其中，立体限定的核苷间基序区域是3-8个或2–8个连续核苷的共有区域，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中，每个共有的立体限定核苷间键基序区域的长度和位置在文库的每个成员之间相...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171013 EP 17196356.4;20180817 EP 18189497.31.一种用于鉴定反义寡核苷酸的改进的立体限定的硫代磷酸酯变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.向母体寡核苷酸提供限定的序列和核苷修饰样式；
b.生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留母体寡核苷酸的限定的序列和核苷修饰样式，
其中
(i)文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸非对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员包含立体限定的核苷间基序区域，其中，立体限定的核苷间基序区域是3-8个或2–8个连续核苷的共有区域，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中，每个共有的立体限定核苷间键基序区域的长度和位置在文库的每个成员之间相同；并且其中，文库的每个成员在立体限定的核苷间基序区域包含不同的共有的立体限定核苷间基序；
或
(ii)其中文库的每个成员是包含立体限定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸非对映异构体的混合物的子文库，其中混合物的每个成员在寡核苷酸中的相同位置处包含共有的立体限定核苷间键基序，其中剩余的核苷间键包含立体无规硫代磷酸酯核苷间键；其中文库的每个成员包含相同的共有的立体限定核苷间键基序，其中共有的立体限定核苷间键基序的位置在文库的每个成员之间不同；
c.对步骤b)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，如与母体寡核苷酸相比，改进的效价和/或降低的毒性；
d.鉴定一个或多个具有改进特性的文库成员。


2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b.包括在步骤b(i)中定义的步骤。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，每个立体限定的核苷间键基序区域的长度是3、4、5或6连续核苷酸(或2、3、4或5个核苷键)。


4.根据权利要求2-3中任一项所述的方法，其中，每个立体限定的核苷间键基序区域是3或4个核苷键。


5.根据权利要求2–4中任一项所述的方法，其中文库在立体限定的核苷间键基序区域内部包含每个可能的立体限定的核苷间键基序的成员。


6.根据权利要求2–5中任一项所述的方法，其中文库的每个成员各自包含
-选自RRR、RSR、RRS、RSS、SSS、SRS、SSR、SRR的三联键基序，或
-选自RRRR、RRRS、RRSR；RSRR、RRSS；RSRS；RSSR；RSSS、SSSS、SSSR；SSRS；SRSS；SSRR；SRSR；SRRS、SRRR的四联键基序，或
-选自RRRRR、RRRRS、RRRSR、RRRSS、RRSRR；RRSRS、RSRRR、RRSSR；RSRSR；RSSRR；RSSSR、SSSSR、SSSRR；SSRSR；SRSSR；SSRRR；SRSRR；SRRSR、SRRRR、RSRRS、RRSSS；RSRSS；RSSRS；RSSSS、SSSSS、SSSRS；SSRSS；SRSSS；SSRRS；SRSRS；SRRSS或SRRRS的五联键基序。


7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中文库是全面的。


8.根据权利要求2–7中任一项所述的方法，其中在每个文库成员的反义寡核苷酸内部至少30％，如至少40％或至少50％，或大部分的或全部的剩余核苷间键是立体无规硫代磷酸酯核苷间键。


9.根据权利要求2–8中任一项所述的方法，其中方法还包括步骤
e)选择在步骤d)中鉴定的至少一个改进的寡核苷酸变体
f)生成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的文库，所述硫代磷酸酯寡核苷酸保留改进的寡核苷酸变体的限定的序列和核苷修饰样式和相同的立体限定的核苷间基序，其中文库的每个成员包含一个或多个其他立体限定的硫代磷酸酯核苷间键，并且其中文库的每个成员就其他立体限定的硫代磷酸酯核苷间键的样式而言不同，
g.对步骤f)中生成的文库的每个成员筛选至少一个改进的特性，所述特性可能与如步骤c)中所分析的不同的改进特性相同。


10.根据权利要求2–9中任一项所述的方法，其中所述方法的步骤b(i)包括产生多个文库，其中每个文库如步骤b(i)中那样限定并且其中每个共有的立体限定核苷间键基序区域的位置在多个文库的每者之间不同，其中每个文库可以是如前述任一项权利要求中所限定的文库。


11.根据权利要求10所述的方法，其中方法还包括步骤：从多个文库的每者鉴定改进的立体限定的变体，并且从多个文库制备又一立体限定的变体，其包含每个鉴定的改...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·布莱谢尔，H·F·汉森，T·科赫，N·阿尔贝克，E·D·丰德，
申请(专利权)人：罗氏创新中心哥本哈根有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK