使用电子显微镜对样品成像的方法技术

本发明专利技术涉及一种对样品成像的方法，所述样品安装在电子显微镜中的样品固持器上，所述电子显微镜包括用于沿着光轴产生高能电子束的电子源和用于聚焦和偏转光束以便用所述电子束照射所述样品的光学元件。所述样品固持器能够相对于所述电子束定位和倾斜所述样品。所述方法包括以下步骤：通过用所述电子束照射所述样品来获取一系列倾斜的图像，且在获取所述图像期间同时改变所述样品的位置，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。

Methods of imaging samples with electron microscope

【技术实现步骤摘要】
使用电子显微镜对样品成像的方法
本专利技术涉及一种使用电子显微镜对样品成像的方法。这种方法的实例从2003年12月31日发布的FEI公司的“技术说明：Tecnai™断层扫描软件的功能说明（Technicalnote:FunctionaldescriptionofTecnai™TomographySoftware）”中可知。
技术介绍
在电子显微镜（例如透射电子显微镜（TEM））中，电子源会产生高能电子束，其可选择的能量例如在80到300keV之间，尽管已知会使用更高和更低的能量。所述光束被光学元件（电子透镜，偏转器，多极）操纵（聚焦，偏转），并照射放置于样品支持器中的样品。样品支持器安置样品，所述支持器通常显示三个平移自由度（x，y，z）和一个旋转自由度（α）或更多旋转自由度。样品足够薄以对电子透明：一些电子被吸收，但是许多电子在散射或未散射的同时通过样品。通常，对于生物样品，样品的厚度在50nm到1μm之间（对于低温样品，样品的厚度在50到200nm之间），且对于半导体样品，其厚度小于100nm。另一组光学元件在检测器上形成样品的放大图像，所述检测器例如是CMOS相机、CCD相机、荧光屏或荧光屏与通过光纤连接的相机的组合。如技术说明中所描述，检测器上形成的图像是样品的2D投影。为了获得3D图像，以所谓的倾斜系列来获取样品在不同旋转方向上的一系列图像。通常，倾斜系列涵盖从-70到+70度的倾斜范围，规则间隔为1或2度。然后将倾斜系列的图像彼此对齐，并使用适当的软件进行3D重建，然后进行可视化。对于倾斜系列的每个图像，样品必须朝向另一个倾斜角度。由于TEM的高分辨率，样品应稳定在例如1nm内或更小。因此，通常使用1秒或更长的弛豫时间来抑制平台的漂移。结果，获取倾斜系列是一个耗时的过程。在以本申请人的名义的美国专利第US9,147,551B2号中描述了一种获取倾斜系列的方法，其中，样品支持器在获取倾斜系列的同时连续改变倾斜角，并且样品的位置连续变化以将样品保持在光轴上。通过更快的获取时间和平滑的倾斜机制的发展而成为可能的这种所谓的“运行中断层扫描（tomo-on-the-fly）”减少了获得倾斜系列所需的时间。期望进一步改进用于获取倾斜系列的方法。特别感兴趣的是提高获得的图像的分辨率，和/或增加可获得倾斜系列的速度。
技术实现思路
为此，提供了一种对样品成像的方法，其中所述方法是根据权利要求1所定义。根据所述方法，使用了能够相对于电子束定向和倾斜样品的样品固持器。所述方法包括以下步骤：通过用电子束照射样品来获取一系列倾斜的图像，以读出速度将图像记录在相机上，其中在获取一系列倾斜的图像的同时连续改变倾斜角。根据第一方面，所述方法进一步包括在获取倾斜系列的同时改变样品的位置的并行步骤。特别地，在获取一系列倾斜的图像的同时，连续改变所述位置。这意味着样品的位置随着倾斜角的改变同时变化。结果是，以相关联的独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。注意，在如上文引用的US9,147,551B2中描述的方法中，样品的位置连续变化以将样品保持在光轴上。因此，实际上，样品位置没有实际的并行变化，因为所描述的方法的明确意图是在获取倾斜系列期间维持固定位置。因此，此现有技术方法导致以相关联的独特倾斜角和单个固定位置获取每个图像。然而，根据本专利技术的上述方面，在样品连续倾斜期间位置连续变化以提供一组独特的倾斜角和一组对应的独特位置。因此，样品的位置变化，从而在所获取的图像集中产生额外的样品信息。由此，实现了本专利技术的目的。注意，改变位置可能包括增加样品的成像部分的步骤，尤其是在获取倾斜系列的过程中。这样，在保持所需的成像分辨率的同时，对样品的较大部分进行成像。在这方面可以想到，借助于样品与电子束之间的相对运动来改变位置。举例来说，样品可以相对于光轴移动。例如，可以通过相对于电子束机械地移动样品来连续改变样品的位置。在另一个实施例中，电子束相对于样品移动。在这方面，还注意到，众所周知的是，执行第一个倾斜系列，随后将样品移至新位置，然后在此新位置执行第二个倾斜系列。以这样的方式选择新位置，使得与先前位置存在一些重叠，使得针对不同倾斜系列的所得图像具有一些重叠并且可以被拼接在一起成为一个或多个最终图像。根据所述已知方法，样品的运动与倾斜系列的获取不是同时的。实际上，样品的移动是在第一倾斜与第二倾斜系列之间的中间步骤。根据本文中所公开的方法，位置的改变与倾斜角的改变是同步的。因此，不会浪费时间来将样品支持器的位置移动和稳定到新的位置。另外，相机正在连续获取图像，从而使得本文中所公开的方法还适用于快速变化的样品。另一个优点是，用于照射样品并撞击相机的所有电子都用于成像，且因此不会发生无用的样品劣化。在这方面，已知特别是生物样品由于由电子照射引起的辐照损伤而劣化。根据另一个方面，一种方法是根据权利要求5所定义。根据这一方面，所述方法包括以下步骤：在获取倾斜系列的同时并行地改变样品的另一倾斜角，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的独特另一倾斜角来获取每个图像。所述另外的倾斜角可以相对于所述倾斜角正交。使用此方法可在单个倾斜系列期间产生有关样品的更多信息，因为它减少了所谓的漏楔现象。由此，实现了本专利技术的目的。因此，从上面可以得出，在获取样品的一系列倾斜的图像的同时，分别连续地改变样品的倾斜角和位置，或者进一步改变样品的倾斜角，会导致更快的获取时间和/或关于样品的更多信息。因此，获得了一种用于对样品成像的改进方法。由此，实现了本专利技术的目的。下面将讨论其它有利的实施例。在实施例中，样品成像于像素化相机上，且以度每秒表示的倾斜角的速度、分别以米每秒或度每秒表示的位置或另一倾斜角的并行变化的速度和以帧每秒表示的相机的速度相匹配，使得在一个帧期间由于倾斜变化而导致的图像位移例如小于一个像素，并且优选地小于½像素。通过这样匹配倾斜速度和读出速度，最佳地使用相机的分辨率。用于这些目的的已知相机包括例如4096×4096像素。相机的读出速度可能受到相机的可能性或一个图像中需要足够数目的电子的限制。注意，有可能集成多个图像，其各自具有低电子数目，但与一个照明时间较长且在集成的图像集中可用的检测电子数目相同的图像相比，这会引起信噪比降低。因此，相比于具有较低帧时间的多个图像的集成，优选具有较长帧时间的一个图像的获取。因此，这可能会导致选择相机的读出速度和样品固持器的倾斜速度，其中每一帧包括足够的电子，不管是对于图像所需（例如用于形成3D重建（断层照片））的多个电子还是用于获取使图像相对于彼此移位（使用例如相关技术）所需的数据。然而，实际上，相机的读出速度是限制因素。因此，选择最高可能的帧速率，并且使剂量率和倾斜速度适应于所述读出速度/帧速率。在实施例中，使用了样品的频闪照明。样品以频闪方式被照明，并且照明脉冲的频率可以与相机帧读出同步。优选地，在每个帧的读出开始时提供单个脉冲。脉冲的持续时间指定了剩余的运动模糊量，并且优选地，选择在技术上尽可能小的持续时间。由于频闪照明，有可能以高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种对样品成像的方法，所述样品安装在电子显微镜中的样品固持器上，所述电子显微镜包括用于沿着光轴产生高能电子束的电子源和用于聚焦和偏转光束以便用所述电子束照射所述样品的光学元件，所述样品固持器能够相对于所述电子束定位和倾斜所述样品，所述方法包括：/n- 通过用所述电子束照射所述样品来获取一系列倾斜的图像，以读出速度将所述图像记录在相机上，其中在获取所述系列倾斜的图像的同时连续地改变所述倾斜角；及/n- 在获取所述倾斜系列的同时改变所述样品的位置，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。/n

【技术特征摘要】
20181126 EP 18208355.01.一种对样品成像的方法，所述样品安装在电子显微镜中的样品固持器上，所述电子显微镜包括用于沿着光轴产生高能电子束的电子源和用于聚焦和偏转光束以便用所述电子束照射所述样品的光学元件，所述样品固持器能够相对于所述电子束定位和倾斜所述样品，所述方法包括：
-通过用所述电子束照射所述样品来获取一系列倾斜的图像，以读出速度将所述图像记录在相机上，其中在获取所述系列倾斜的图像的同时连续地改变所述倾斜角；及
-在获取所述倾斜系列的同时改变所述样品的位置，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。


2.根据权利要求1所述的方法，其中改变所述位置包括增加所述样品的成像部分。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述位置是通过所述样品与所述电子束之间的相对运动而改变的。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品的所述位置通过相对于所述电子束机械地移动所述样品而连续地改变。


5.一种对样品成像的方法，所述样品安装在电子显微镜中的样品固持器上，所述电子显微镜包括用于沿着光轴产生高能电子束的电子源和用于聚焦和偏转光束以便用电子束照射所述样品的光学元件，所述样品固持器能够相对于所述电子束定位和倾斜所述样品，所述方法包括：
-通过用所述电子束照射所述样品来获取一系列倾斜的图像，以读出速度将所述图像记录在相机上，其中在获取所述系列倾斜的图像的同时连续地改变所述倾斜角；及
-在获取所述系列倾斜的图像的同时改变所述样品的另一倾斜角，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的另一独特倾斜角获取每个图像。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述另一倾斜角相对于所述倾斜角正交。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在像素化相机上成像，且以度每秒表示的所述倾斜角的速度、分别以米每秒或度每秒表示的位置或另一倾斜角的所述分别并行改变的速度和以帧每秒表示的所述相机...

【专利技术属性】
技术研发人员：EM弗兰肯，R肖恩马克思，BJ詹森，M弗海延，H科尔，Y邓，A福格特，
申请(专利权)人：FEI公司，
类型：发明
国别省市：美国;US