一种无酶电化学适体细胞传感器、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于细胞检测技术领域，公开了一种无酶电化学适体细胞传感器、制备方法及应用。本发明专利技术通过原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子，通过肝癌细胞与捕获适体(巯基化的TLS11a)的特异性结合作用捕获目标肝癌细胞，进而将甲苯胺蓝(Tb)与血红素/G‑四联体标记的Fe

An enzyme-free electrochemical aptamer cell sensor, its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种无酶电化学适体细胞传感器、制备方法及应用
本专利技术涉及细胞检测
，具体涉及一种无酶电化学适体细胞传感器、制备方法及应用，更具体涉及一种通过杂化纳米材料催化底物过氧化氢产生还原电流，从而检测肝癌细胞浓度，属于超灵敏的电化学细胞传感器的制备技术。
技术介绍
甲胎蛋白(AFP)常被用作筛选和诊断原发性肝癌的生物标志物。然而，AFP作为肝癌标志物并不可靠，因为血清中AFP的浓度可能在许多其他肝病中更高。因此对于肝癌的监测，在临床研究中仅仅检测甲胎蛋白(AFP)的水平是不可信的。因此，准确灵敏检测分析肝癌细胞在肿瘤诊断和治疗中具有重要的临床意义。为了实现这个目标，有必要建立一个直接的方法来实现对人肝癌细胞的灵敏检测。到目前为止，已经引入了很多技术和方法来实现对癌细胞的检测，包括流式细胞术、免疫组化、质谱、聚合酶链反应(PCR)、微流控技术、电化学发光、荧光分析和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等。尽管这些方法被广泛使用，但其中许多方法耗时、耗力、成本高、需要复杂的仪器和高水平的专业技能。相比之下，电化学生物传感器由于其易于操作、成本低、响应快等优点，越来越受到人们的关注，但在肝癌细胞(HepG2)中普遍存在灵敏度不高的问题。电化学生物传感器中信号标记物是影响检测灵敏度的重要因素。因此，设计可以可以用于检测肝癌细胞且能够放大电化学信号的信号标记物对于提高电化学生物传感器的灵敏度具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是通过原位生长法制备金纳米粒子修饰的玻碳电极，通过特定捕获适体与肝癌细胞的特异性结合作用，捕获目标癌细胞，将甲苯胺蓝(Tb)与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料负载在电极表面，催化过氧化氢产生还原电流，实现对肝癌细胞的灵敏、准确检测。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种无酶电化学适体细胞传感器的制备方法，包括以下步骤：S1.利用原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子，用二次水冲洗后在室温下干燥；S2.将捕获适体修饰在步骤S1获得的玻碳电极的工作区域，采用牛血清白蛋白溶液封闭非特异性结合位点，然后利用所述捕获适体捕获肝癌细胞；S3.将信号标记物分散在1mL水中，然后滴加在步骤S2获得的捕获有肝癌细胞的玻碳电极的工作区域内，在37℃下孵育1小时，并用磷酸盐缓冲溶液冲洗；其中，所述信号标记物为甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料。优选的，所述信号标记物的制备包括以下步骤：S31.将100μL浓度为2μM的巯基化的信号适体、50μL浓度为3mM的甲苯胺蓝与2mL浓度为2mg/mL的Fe3O4@Au核壳纳米粒子混合，在4℃下搅拌12个小时得到混合溶液A；S32.将200μL浓度为0.5mg/mL血红素加入到所述混合溶液A中并在4℃下搅拌2小时，得到血红素/G-四联体结构的混合溶液B；S33.将50μL浓度为1wt％的牛血清白蛋白溶液加入到所述混合溶液B中反应30分钟，离心洗涤后，得甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料，即信号标记物。本专利技术中，巯基化的信号适体的序列为：5’-HS-(CH2)6-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG-Spacer18-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’，其中，TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG为G-四联体形成的序列，Spacer-18连接由PEG组成，这样设计便于减少干扰。优选的，所述利用原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子的具体步骤为：S11.将玻碳电极分别用0.3μm粒径和0.05μm粒径的Al2O3粉末抛光打磨并用二次水冲洗，再在无水乙醇和二次水的混合溶液中超声清洗2分钟后再用二次水冲洗干净，用吸耳球吹干所述玻碳电极；S12.将步骤S11处理过的玻碳电极置于浓度为1wt％的HAuCl4溶液中，在电位为-0.2V的条件下循环伏安扫描30秒，使金纳米粒子电沉积到玻碳电极表面。优选的，所述捕获适体为巯基化的TLS11a适体，所述捕获适体的浓度为2～2.2μM。本专利技术中，巯基化的TLS11a适体的序列为5’-HS-(CH2)6-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG-3’。巯基化的TLS11a适体可以特异性识别HepG2细胞。优选的，所述步骤S2具体为：将10μL捕获适体滴到沉积有金纳米粒子的玻碳电极工作区域，在4℃下孵育16小时，滴加10μL浓度为1wt％牛血清白蛋白溶液用于封堵非特异性结合位点，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后，继续滴加20μL不同浓度的肝癌细胞悬浮液，在37℃下孵育1小时，随后用磷酸盐缓冲溶液洗去未反应的肝癌细胞。优选的，所述Fe3O4@Au核壳纳米粒子的粒径为380-385nm。本专利技术还提供了一种上述制备方法制备得到的无酶电化学适体细胞传感器。本专利技术还提供了一种上述无酶电化学适体细胞传感器在肝癌细胞HepG2检测方面的应用。优选的，所述应用具体为：基于所述无酶电化学适体细胞传感器，采用计时安培法结合电化学工作站对肝癌细胞HepG2检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：(1)在玻碳电极表面电沉积金纳米粒子，增大了比表面积，提高了导电性和生物相容性，有利于固载更多的信号适体，降低检测限。(2)利用Tb和hemin/G-四联体标记的Fe3O4@Au核壳纳米粒子作为纳米电催化剂，其中，Fe3O4@Au可作为纳米载体固载更多的电活性物质和识别探针，甲苯胺蓝(Tb)是一种常用的电子传递媒介来提供电化学信号。含有氨基的Tb和末端氨基修饰的信号适体可通过Au-N键偶联到Fe3O4@Au纳米粒子上，当引入hemin后，形成了大量的hemin/G-四联体DNA酶，可以共催化H2O2的还原，促进Tb的电子转移，进一步放大了电化学信号，进而提高检测的灵敏度。(3)基于杂化纳米材料，利用信号放大策略，构建了用于检测肝癌细胞的无酶电化学细胞传感器，可以实现简单、高效、灵敏地检测肝癌细胞，在肝癌的早期诊断和治疗中具有重大的意义。附图说明图1为本专利技术中信号标记物的制备过程示意图；图2为本专利技术中构建的无酶电化学适体细胞传感器的构建过程示意图；图3为本专利技术中Fe3O4@Au核壳纳米粒子透射电镜图像和粒径分布图；图4为本专利技术中不同的信号标记物制备的无酶电化学适体细胞传感器的计时电流响应曲线对比图：图5为本专利技术中无酶电化学适体细胞传感器检测不同浓度的HepG2细胞的响应电流的线性曲线。具体实施方式以下实施例中用到的试剂和仪器：血红素(hemin)和甲苯胺蓝(Tb)购于sigma-Aldrich。柠檬酸钠(Na3Cit·2H2O，≥99.0％)、六水三氯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无酶电化学适体细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.利用原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子，用二次水冲洗后在室温下干燥；/nS2.将捕获适体修饰在步骤S1获得的玻碳电极的工作区域，采用牛血清白蛋白溶液封闭非特异性结合位点，然后利用所述捕获适体捕获肝癌细胞；/nS3.将信号标记物分散在1mL水中，然后滴加在步骤S2获得的捕获有肝癌细胞的玻碳电极的工作区域内，在37℃下孵育1小时，并用磷酸盐缓冲溶液冲洗；/n其中，所述信号标记物为甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe

【技术特征摘要】
1.一种无酶电化学适体细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.利用原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子，用二次水冲洗后在室温下干燥；
S2.将捕获适体修饰在步骤S1获得的玻碳电极的工作区域，采用牛血清白蛋白溶液封闭非特异性结合位点，然后利用所述捕获适体捕获肝癌细胞；
S3.将信号标记物分散在1mL水中，然后滴加在步骤S2获得的捕获有肝癌细胞的玻碳电极的工作区域内，在37℃下孵育1小时，并用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
其中，所述信号标记物为甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述信号标记物的制备包括以下步骤：
S31.将100μL浓度为2μM的巯基化的信号适体、50μL浓度为3mM的甲苯胺蓝与2mL浓度为2mg/mL的Fe3O4@Au核壳纳米粒子混合，在4℃下搅拌12个小时得到混合溶液A；
S32.将200μL浓度为0.5mg/mL血红素加入到所述混合溶液A中并在4℃下搅拌2小时，得到血红素/G-四联体结构的混合溶液B；
S33.将50μL浓度为1wt％的牛血清白蛋白溶液加入到所述混合溶液B中反应30分钟，离心洗涤后，得甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料，即信号标记物。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述利用原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子的具体步骤为：
S11.将玻碳电极分别用0.3μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金霞，吴丽，周晓波，秦玉岭，冀海伟，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32