【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】甲基化分析方法
本专利技术总体上涉及一种用于评估DNA甲基化的方法。更具体地说，本专利技术涉及一种以更高的灵敏度对全部或部分甲基化DNA的胞嘧啶甲基化进行定性或定量评估的方法。本专利技术的方法具有多种用途，包括但不限于病症诊断或监测以胞嘧啶甲基化变化为特征的表型的发展。
技术介绍
本说明书中对任何先前出版物(或从其衍生的信息)或任何已知事项的引用不是也不应该被视为承认或认可或以任何形式暗示该先前出版物(或从其衍生的信息)或已知事项构成本说明书所涉及的
中的公知常识的一部分。作者在本说明书中所引用的出版物的书目细节在具体实施方式后面按字母顺序列出。DNA甲基化是哺乳动物中研究最深入的表观遗传修饰之一，是指在胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)核苷酸上增加一个甲基(CH3)。该甲基可以添加到胞嘧啶碱基的第五个碳原子或腺嘌呤碱基的第六个氮原子上。DNA甲基化在动物细胞的基因调控中起作用。除了活性基因转录和低甲基化之间存在相关性外，转染实验还显示甲基部分的存在抑制了体内基因表达。此外，基因激活可以通过用5-氮杂胞...
【技术保护点】
1.一种筛查目标DNA区域甲基化的方法，所述方法包括：/n(i)将DNA样本与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触，其中所述样本包括所述目标DNA区域的靶链和相反链；/n(ii)将步骤(i)的所述DNA样本与以下物质接触：/na)第一组正向和反向引物，其用于扩增所述目标DNA区域的所述修饰靶链的一种或多种完全或部分甲基化形式；/nb)第二组正向和反向引物，其用于扩增所述目标DNA区域的所述修饰相反链的一种或多种完全或部分甲基化形式；以及/nc)如果步骤(a)和(b)的所述引物是甲基化特异性的，则任选一种或多种针对所述靶链和相反链中的每一条的探针，或者如果步骤(a)和(b)的所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170915 AU 20179037721.一种筛查目标DNA区域甲基化的方法，所述方法包括：
(i)将DNA样本与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触，其中所述样本包括所述目标DNA区域的靶链和相反链；
(ii)将步骤(i)的所述DNA样本与以下物质接触：
a)第一组正向和反向引物，其用于扩增所述目标DNA区域的所述修饰靶链的一种或多种完全或部分甲基化形式；
b)第二组正向和反向引物，其用于扩增所述目标DNA区域的所述修饰相反链的一种或多种完全或部分甲基化形式；以及
c)如果步骤(a)和(b)的所述引物是甲基化特异性的，则任选一种或多种针对所述靶链和相反链中的每一条的探针，或者如果步骤(a)和(b)的所述引物不是甲基化特异性的，则任选一种或多种针对所述靶链和相反链的甲基化特异性探针，其中所述探针包含检测手段；
(iii)扩增步骤(ii)的所述DNA样本，其中如果使用步骤(ii)(c)的一种或多种所述探针，所述引物沿所述基因的延伸影响所述杂交探针的检测；以及
(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。
2.一种诊断或监测患者病症的方法，所述病症的特征在于目标DNA区域甲基化的调节，所述方法包括：
(i)将DNA样本与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触，其中所述样本包括所述目标DNA区域的靶链和相反链；
(ii)将步骤(i)的所述DNA样本与以下物质接触：
a)第一组正向和反向引物，其用于扩增所述目标DNA区域的所述修饰靶链的一种或多种完全或部分甲基化形式；
b)第二组正向和反向引物，其用于扩增所述目标DNA区域的所述修饰相反链的一种或多种完全或部分甲基化形式；以及
c)如果步骤(a)和(b)的所述引物是甲基化特异性的，则任选一种或多种针对所述靶链和相反链中的每一条的探针，或者如果步骤(a)和(b)的所述引物不是甲基化特异性的，则任选一种或多种针对所述靶链和相反链的甲基化特异性探针，其中所述探针包含检测手段；
(iii)扩增步骤(ii)的所述DNA样本，其中如果使用步骤(ii)(c)的一种或多种所述探针，所述引物沿所述基因的延伸影响所述杂交探针的检测；以及
(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述DNA样本包含所述目标DNA区域的低拷贝数。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中分析所述目标DNA区域内一个或多个CpG位点的甲基化。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述病症是肿瘤疾病。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述目标核酸靶是DNA基因或基因区域。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述DNA是基因组DNA。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述基因区是启动子区。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述基因是哺乳动物基因。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述基因是肿瘤标志物，例如大肠肿瘤标志物，特别是腺瘤或腺癌的标志物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述大肠肿瘤标志物是以下基因中的一种或多种：
并且其中所述基因包括转录起始位点上游5kb。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述大肠肿瘤标志物是基因BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP或CAHM中的一个或多个，或者是所述转录起始位点上游5kb。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述大肠肿瘤标志物选自(i)BCAT1和IKZF1；(ii)BCAT1、IKZF1和IRF4；(iii)BCAT1、IKZF1和GRASP；(iv)BCAT1、IKZF1和CAHM；(iv)BCAT1、IKZF1、IRF4和GRASP；(v)BCAT1、IKZF1、IRF4和CAHM或(vi)BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP和CAHM，或这些基因转录起始位点上游5kb。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述试剂将未甲基化的胞嘧啶残基修饰为尿嘧啶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐是亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法使用甲基化特异性引物，但不使用探针。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法使用甲基化特异性引物和非甲基化特异性探针。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法使用甲基化特异性引物和甲基化特异性探针。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法使用非甲基化特异性引物和甲基化特异性探针。
21.根据权利要求1至16和18至20中任一项所述的方法，其中所述探针是水解探针。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述探针共同杂交到所述目标DNA区域的所有完全和部分甲基化模式。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基因是IKZF1，并且
(i)所述第一组引物包括以下序列：
SEQIDNO:11(正向引物):Chr7(+)；50,304,271-50,304,294
5'GACGACGTATTTTTTTCGTGTTTC-3'
SEQIDNO:12(反向引物):Chr7(-)；50,304,350-50,304,365
5'-GCGCACCTCTCGACCG-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第一组引物的扩增产物的探针包括一个或多个选自以下的序列：
SEQIDNO:135'-TTTGTATYGGAGTAGYGATTYGGGAGG-3'
SEQIDNO:145'-TTTGTATCGGAGTAGCGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:155'-TTTGTATCGGAGTAGCGATTTGGGAGG-3'
SEQIDNO:165'-TTTGTATCGGAGTAGTGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:175'-TTTGTATTGGAGTAGCGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:185'-TTTGTATCGGAGTAGTGATTTGGGAGG-3'
SEQIDNO:195'-TTTGTATTGGAGTAGCGATTTGGGAGG-3'
SEQIDNO:205'-TTTGTATTGGAGTAGTGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:215'-TTTGTATTGGAGTAGTGATTTGGGAGG-3'
或者基本相似的序列；以及
(ii)所述第二组引物包括以下序列：
SEQIDNO:77(正向引物):Chr7(-)；50,304,295-50,304,314
5'-CGCGTAGAAGGGCGTAGAGC-3'
SEQIDNO:78(反向引物):Chr7(+)；50,304,234-50,304,254
5'-GCGCGAACCGAAAAACTCGAC-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第二组引物的扩增产物的探针包括一个或多个选自以下的序列：
SEQIDNO:795'-AAYGAYGCACCCTCTCYGTATCCY-3'
SEQIDNO:805'-AACGACGCACCCTCTCCGTATCCT-3'
SEQIDNO:815'-AATGACGCACCCTCTCCGTATCCC-3'
SEQIDNO:825'-AACGATGCACCCTCTCCGTATCCC-3'
SEQIDNO:835'-AACGACGCACCCTCTCTGTATCCC-3'
SEQIDNO:845'-AATGATGCACCCTCTCCGTATCCC-3'
SEQIDNO:855'-AATGACGCACCCTCTCTGTATCCC-3'
SEQIDNO:865'-AATGACGCACCCTCTCCGTATCCT-3'
SEQIDNO:875'-AACGATGCACCCTCTCTGTATCCC-3'
SEQIDNO:885'-AACGATGCACCCTCTCCGTATCCT-3'
SEQIDNO:895'-AACGACGACCCTCTCTGTATCCT-3'
SEQIDNO:905'-AATGATGCACCCTCTCTGTATCCC-3'
SEQIDNO:915'-AATGACGCACCCTCTCTGTATCCT-3'
SEQIDNO:925'-AACGATGCACCCTCTCTGTATCCT-3'
SEQIDNO:935'-AATGATGCACCCTCTCTGTATCCT-3'
SEQIDNO:945'-AACGACGCACCCTCTCCGTATCCC-3'
SEQIDNO:955'-AATGATGCACCCTCTCCGTATCCT-3'
或者基本相似的序列。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基因是IKZF1，并且
(i)所述第一组引物包括以下序列：
SEQIDNO:11(正向引物):Chr7(+)；50,304,271-50,304,294
5'GACGACGTATTTTTTTCGTGTTTC-3'
SEQIDNO:12(反向引物):Chr7(-)；50,304,350-50,304,365
5'-GCGCACCTCTCGACCG-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第一组引物的扩增产物的探针包括一个或多个选自以下的序列：
SEQIDNO:135'-TTTGTATYGGAGTAGYGATTYGGGAGG-3'
SEQIDNO:145'-TTTGTATCGGAGTAGCGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:155'-TTTGTATCGGAGTAGCGATTTGGGAGG-3'
SEQIDNO:165'-TTTGTATCGGAGTAGTGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:175'-TTTGTATTGGAGTAGCGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:185'-TTTGTATCGGAGTAGTGATTTGGGAGG-3'
SEQIDNO:195'-TTTGTATTGGAGTAGCGATTTGGGAGG-3'
SEQIDNO:205'-TTTGTATTGGAGTAGTGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:215'-TTTGTATTGGAGTAGTGATTTGGGAGG-3'
或者基本相似的序列；以及
(ii)所述第二组引物包括以下序列：
SEQIDNO:22(正向引物):Chr7(-)；50,304,366-50,304,391
5'-TTGTTTCGTAGTCGGTTCGGTTTCG3'
SEQIDNO:23(反向引物):Chr7(+)；50,304,271-50,304,294
5'-AACGACGCACCCTCTCCGTATCCC-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第二组引物的扩增产物的探针包括一个或多个选自以下的序列：
SEQIDNO:245'-TTTTTYGGATYGTTGTTTYGGTATAGG-3'
SEQIDNO:255'-TTTTTCGGATCGTTGTTTCGGTATAGG-3'
SEQIDNO:265'-TTTTTCGGATCGTTGTTTTGGTATAGG-3'
SEQIDNO:275'-TTTTTCGGATTGTTGTTTCGGTATAGG-3'
SEQIDNO:285'-TTTTTTGGATCGTTGTTTCGGTATAGG-3'
SEQIDNO:295'-TTTTTCGGATTGTTGTTTTGGTATAGG-3'
SEQIDNO:305'-TTTTTTGGATTGTTGTTTCGGTATAGG-3'
SEQIDNO:315'-TTTTTTGGATCGTTGTTTTGGTATAGG-3'
SEQIDNO:325'-TTTTTTGGATTGTTGTTTTGGTATAGG-3'
或者基本相似的序列。
25.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基因是IKZF1，并且
(i)所述第一组引物包括以下序列：
SEQIDNO:11(正向引物):Chr7(+)；50,304,271-50,304,294
5'-GACGACGTATTTTTTTCGTGTTTC-3'
SEQIDNO:12(反向引物):Chr7(-)；50,304,350-50,304,365
5'-GCGCACCTCTCGACCG-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第一组引物的扩增产物的探针包括一个或多个选自以下的序列：
SEQIDNO:135'-TTTGTATYGGAGTAGYGATTYGGGAGG-3'
SEQIDNO:145'-TTTGTATCGGAGTAGCGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:155'-TTTGTATCGGAGTAGCGATTTGGGAGG-3'
SEQIDNO:165'-TTTGTATCGGAGTAGTGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:175'-TTTGTATTGGAGTAGCGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:185'-TTTGTATCGGAGTAGTGATTTGGGAGG-3'
SEQIDNO:195'-TTTGTATTGGAGTAGCGATTTGGGAGG-3'
SEQIDNO:205'-TTTGTATTGGAGTAGTGATTCGGGAGG-3'
SEQIDNO:215'-TTTGTATTGGAGTAGTGATTTGGGAGG-3'
或者基本相似的序列；以及
(ii)所述第二组引物包括以下序列：
SEQIDNO:33(正向引物):Chr7(-)；50,304,329-50,304,355
5'-CGGTCGTTTTTCGGATCGTTGTTTCGG-3'
SEQIDNO:23(反向引物):Chr7(+)；50,304,271-50,304,294
5'-AACGACGCACCCTCTCCGTATCCC-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第二组引物的扩增产物的探针包括一个或多个选自以下的序列：
SEQIDNO:345'-YGYGTAGAAGGGYGTAGAGYG-3'
SEQIDNO:355'-CGCGTAGAAGGGCGTAGAGCG-3'
SEQIDNO:365'-CGCGTAGAAGGGCGTAGAGTG-3'
SEQIDNO:375'-CGCGTAGAAGGGTGTAGAGTG-3'
SEQIDNO:385'-CGTGTAGAAGGGTGTAGAGTG-3'
SEQIDNO:395'-TGTGTAGAAGGGTGTAGAGTG-3'
SEQIDNO:405'-TGCGTAGAAGGGCGTAGAGCG-3'
SEQIDNO:415'-CGTGTAGAAGGGCGTAGAGCG-3'
SEQIDNO:425'-CGCGTAGAAGGGTGTAGAGCG-3'
SEQIDNO:435'-TGTGTAGAAGGGCGTAGAGCG-3'
SEQIDNO:445'-TGCGTAGAAGGGTGTAGAGCG-3'
SEQIDNO:455'-TGCGTAGAAGGGCGTAGAGTG-3'
SEQIDNO:465'-TGTGTAGAAGGGTGTAGAGCG-3'
SEQIDNO:475'-TGTGTAGAAGGGCGTAGAGTG-3'
SEQIDNO:485'-TGCGTAGAAGGGTGTAGAGTG-3'
SEQIDNO:495'-CGTGTAGAAGGGCGTAGAGTG-3'
SEQIDNO:505'-CGTGTAGAAGGGTGTAGAGCG-3'
或者基本相似的序列。
26.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基因是BCAT1，并且
(i)所述第一组引物包括以下序列：
SEQIDNO:97(正向引物):chrl2(+)；24,949,138-24,949,164
5'-TTAGTGTTTTTTTGTTGATGTAATTCG-3'
SEQIDNO:65(反向引物):chrl2(-)；24,949,058-24,949,074
5'-CAATACCCGAAACGACGACG-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第一组引物的扩增产物的探针包括以下序列：
SEQIDNO:665'-TTCGTCGCGAGAGGGTCGGTT-3'
或者基本相似的序列；以及
(ii)所述第二组引物包括以下序列：
SEQIDNO:96(正向引物):chrl2(-)；24,949,058-24,949,082
5'-TAGTGTTCGAGGCGGCGGCGAGTAT-3'
SEQIDNO:62(反向引物):chrl2(+)；24,949,140-24,949,159
5'-ATCTTCCTACTAATACAATCCGCTAAATC-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第二组引物的扩增产物的探针包括以下序列：
SEQIDNO:635'-GATCGGTTTTTTCGCGGCGGA-3'
或者基本相似的序列。
27.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基因是BCAT1，并且
(i)所述第一组引物包括以下序列：
SEQIDNO:64(正向引物):chrl2(+)；24,949,131-24,949,159
5'-GTTTTTTTGTTGATGTAATTCGTTAGGTC-3'
SEQIDNO:65(反向引物):chrl2(-)；24,949,058-24,949,074
5'-CAATACCCGAAACGACGACG-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第一组引物的扩增产物的探针包括以下序列：
SEQIDNO:665'-TTCGTCGCGAGAGGGTCGGTT-3'
或者基本相似的序列；以及
(ii)所述第二组引物包括以下序列：
SEQIDNO:61(正向引物):chrl2(-)；24,949,058-24,949,085
5'-TAGTGTTCGAGGCGGCGGCGAGTATACG-3'
SEQIDNO:62(反向引物):chrl2(+)；24,949,140-24,949,159
5'-ATCTTCCTACTAATACAATCCGCTAAATC-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第二组引物的扩增产物的探针包括以下序列：
SEQIDNO:635'-GATCGGTTTTTTCGCGGCGGA-3'
或者基本相似的序列。
28.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基因是IRF4，并且
(i)所述第一组引物包括以下序列：
SEQIDNO:108(正向引物):Chr6(+):391,546-391,564
5'-GGCGCGGGAATTTTATTTC-3'
SEQIDNO:109(反向引物):Chr6(-):391,605-391,622
5'-AAACCGACCGAACGAACG-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第一组引物的扩增产物的探针包括以下序列：
SEQIDNO:1105'-AAAACCGACGTAAAAACTAAAAACTACCGCGA-3'
或者基本相似的序列；以及
(ii)所述第二组引物包括以下序列：
SEQIDNO:111(正向引物):Chr6(-):391,614-391,636
5'-TAAGTCGAGAGTCGGGGTCGGTC-3'
SEQIDNO:112(反向引物):Chr6(+):391,524-391,539
5'-CGACGCGCGAAAAATC-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第二组引物的扩增产物的探针包括一个或多个选自以下的序列：
SEQIDNO:1135'-CCAACCTTCACGCCGACCCTAAAACTCG-3'
SEQIDNO:1155'-CCTTCACGCCGACCCTAAAACTCG-3'
或者基本相似的序列。
29.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基因是IRF4，并且
(i)所述第一组引物包括以下序列：
SEQIDNO:108(正向引物):Chr6(+):391,546-391,564
5'-GGCGCGGGAATTTTATTTC-3'
SEQIDNO:109(反向引物):Chr6(-):391,605-391,622
5'-AAACCGACCGAACGAACG-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第一组引物的扩增产物的探针包括以下序列：
SEQIDNO:1105'-AAAACCGACGTAAAAACTAAAAACTACCGCGA-3'
或者基本相似的序列；以及
(ii)所述第二组引物包括以下序列：
SEQIDNO:114(正向引物):Chr6(-):391,614-391,630
5'-GAGAGTCGGGGTCGGTC-3'
SEQIDNO:112(反向引物):Chr6(+):391,524-391,539
5'-CGACGCGCGAAAAATC-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第二组引物的扩增产物的探针包括一个或多个选自以下的序列：
SEQIDNO:1135'-CCAACCTTCACGCCGACCCTAAAACTCG-3'
SEQIDNO:1155'-CCTTCACGCCGACCCTAAAACTCG-3'
或者基本相似的序列。
30.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基因是IRF4，并且
(i)所述第一组引物包括以下序列：
SEQIDNO:108(正向引物):Chr6(+):391,546-391,564
5'-GGCGCGGGAATTTTATTTC-3'
SEQIDNO:109(反向引物):Chr6(-):391,605-391,622
5'-AAACCGACCGAACGAACG-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第一组引物的扩增产物的探针包括以下序列：
SEQIDNO:1105'-AAAACCGACGTAAAAACTAAAAACTACCGCGA-3'
或者基本相似的序列；以及
(ii)所述第二组引物包括以下序列：
SEQIDNO:116(正向引物):Chr6(-):391,624-391,649
5'-GAGAGGGATTTTGTAAGTCGAGAGTC-3'
SEQIDNO:112(反向引物):Chr6(+):391,524-391,539
5'-CGACGCGCGAAAAATC-3'
或者基本相似的序列，并且针对所述第二组引物的扩增产物的探针包括一个或多个选自以下的序列：
SEQIDNO:1135'-CCAACCTTCACGCCGACCCTAAAACTCG-3'
SEQIDNO:1155'-CCTTCACGCCGACCCTAAAACTCG-3'
或者基本相似的序列。
31.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏珊·卡丁·佩德森，尼古拉·罗莎琳德·博尔特，
申请(专利权)人：临床基因组学私人有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU
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