血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血清中维生素D代谢物‑25（OH）D3的提取方法及检测方法，该提取方法包括：1）使25（OH）D3从沉淀蛋白中释放出，再瞬离至少一次，从而获得含有25（OH）D3、磷脂和蛋白质的混合物样品；2）利用硅藻土萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；3）对硅藻土萃取板进行洗脱，然后压合硅藻土萃取板和收集板从而收集含有25（OH）D3的洗脱液；4）吹干收集板，并复溶维生素D；该检测方法包括将血清中维生素D代谢物‑25（OH）D3的提取方法所获的25（OH）D3的复溶液作为待检测物；将待检测物上样至液相色谱串联质谱仪检测。本发明专利技术提供的提取方法即萃取方法,可同时完成样品富集与净化，萃取率更高,能够大大提高后续检测的灵敏度。

Extraction and determination of vitamin D metabolite-25 (OH) D3 in serum

【技术实现步骤摘要】
血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法及检测方法
本专利技术涉及一种生化检测方法，特别涉及一种血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法及检测方法。
技术介绍
维生素D(vitaminD)为脂溶性的固醇类物质，简称VD，目前认为维生素D也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中最重要的成员是VD2（麦角钙化醇）和VD3（胆钙化醇)。VD2和VD3在化学结构上存在侧链不同的差异，尚无明确证据证明两者生理功能存在不同。自然界中含维生素D的天然食物不多，野生鲑鱼和经紫外线照射的蘑菇中含有VD。VD也可以通过VD强化食物摄入，最常见VD强化食物是牛奶，其次还包括一些谷物、果汁和人造黄油等。在VD代谢过程中，VD前体物分别以7-脱氢胆固醇(7-Dehydrocholestero1)和麦角固醇的形式，存在于所有陆地脊椎动物(包括人类)的皮肤和植物中，经日光中高能量的B型紫外光照射激发后转化为VD，进而在人或动物肝脏和肾脏VD羟化酶的催化下先后形成25羟基维生素D(25（OH）D3)和l，25二羟维生素D(1,25[OH]2D)。而1,25(OH)2D是在体内产生生物学作用的活性形式，因而又称之为活性VD。1,25二羟维生素D的合成受血清钙、磷浓度和甲状旁腺素(Parathyroidhormone-PTH)的调节。当血钙浓度降低时，刺激甲状旁腺分泌甲状旁腺素，同时增强肾脏lα羟化酶的活性，使活性VD合成增加。后者又通过反馈调节机制抑制甲状旁腺素的分泌。形成VD和钙磷代谢的协调机制。除此之外，大量观察性研究数据支持血清中的25（OH）D3水平与慢性代谢性疾病、心血管疾病和肿瘤的发生均相关，因此维生素D的骨骼外作用引起了很大的关注。针对中国成人骨骼健康，推荐维生素D参考值采用美国健康研究院、英国骨质疏松学会和澳大利亚骨质疏松学会（OsteoporosisAustralia）的标准，即25（OH）D3≥50nmol/L并且≤150nmol/L，可以认为维生素D足够；中国是一个幅员辽阔的多民族国家，近年来对维生素D状况逐渐关注，有不同地区和人群的维生素D状况报道，结果显示很大差异。可以发现，中国人群中维生素D缺乏症普遍存在，即使在日光充沛的南方地区也是如此；同时，老年人和孕妇是维生素D缺乏症高危人群。如果采用25（OH）D3<50nmol/L（20ng/mL）定义维生素D缺乏症，多数地区报道维生素D缺乏症发生率高于60%；如果采用25（OH）D3<75nmol/L（30ng/mL）定义维生素D缺乏症，则多数地区报道维生素D缺乏症发生率高于90%。维生素D的推荐补充剂量和耐受上限随着年龄和特定环境的差异而不同，可采用日剂量、周剂量、月剂量或者每4个月一次口服以维持维生素D。对于孕期妇女而言，25（OH）D3通过胎盘进入胎儿血液。由于25（OH）D3半衰期为2-3周，因此在母体25（OH）D3充足的情况下，胎儿出生后几周内维生素D水平将会维持在一个正常水平内。但是很多研究表明大多数孕妇和新生儿存在维生素D缺乏，孕期以2000-4000IU/d剂量补充维生素D可改善孕妇及新生儿的25（OH）D3水平。特殊情况下，比如肥胖，需要正常剂量的2-5倍来治疗或者防止维生素D缺乏；服用抗惊厥药物、艾滋病药物及糖皮质激素的病人通常需要服用更高的维生素D剂量；肉芽肿性疾病，比如结节病和结核病在25（OH）D3水平超过30ng/mL（75nmol/L）情况下容易产生高钙尿症和高钙血症，原因是由于患者体内巨噬细胞和肉芽肿产生的活性维生素D（1,25[OH]2D）水平升高，因此，这类患者服用维生素D需要得到监控。多种因素会导致维生素D水平下降，就人体自身合成而言，防晒措施能使维生素D3合成量降低95%-99%；也有研究显示，深色皮肤的人群维生素D合成能力相较白人低。除此之外，空气污染导致臭氧和二氧化氮上升进而吸收紫外线辐射引起维生素D缺乏症。季节变化也会影响维生素D水平。冬春季节维生素D缺乏或不足流行程度大于夏季。老年人群尤其存在与维生素D缺乏相关临床症状的风险，随着年龄的增长，穿着方式改变、户外活动减少等因素通常会使日光暴露减少引起维生素D合成下降。有研究显示，与8-18岁青少年相比，77-82岁老年人的维生素D合成能力下降两倍，因此老年人常常存在维生素D缺乏风险。由于母体是新生儿维生素D需求的唯一来源，孕妇孕期缺乏维生素D通常导致新生儿维生素D缺乏，增大儿童佝偻病发病风险。据统计，美国、加拿大、欧洲、新西兰分别有27%-91%、39%-65%、19%-96%和25%-87%孕妇存在维生素D缺乏或者不足。肥胖人群由于体脂会截留维生素D，需要正常剂量的2-5倍来治疗或者防止维生素D缺乏。服用抗癫痫药物、抗惊厥药物、艾滋病药物及糖皮质激素的病人。维生素D与健康的关系：1、骨质疏松症，VD最早名为抗佝偻病维生素,就是由于能够预防佝偻病和软骨病而得名，其原理是VD对钙磷代谢和骨钙化的作用；2、肌无力和肌痛，跌跤引起骨折是老年人的常见病，其原因主要有三：骨质疏松症、肌无力、共济失调，这三个因素都与VD缺乏有关。冰岛对5461位66-96岁老年人做了5.4年的随访调查，发现相对于50-75nmol/L（20-30ng/mL）组，血清VD水平小于30nmol/L（12ng/mL）组股骨折风险上升2.08倍；癌症，VD与癌症的关系是最引人关注，也是最具争议的焦点问题之一，大量流行病学研究发现，VD缺乏或不足时，即25（OH）D3低于20ng/mL(50nmol/L)时，多种癌症发病风险上升，在体外实验中，也确定1,25（OH）D3可以抑制癌细胞的生长，促进癌细胞的分化和凋亡；4、其他疾病大量流行病学和临床资料表明，血液中25（OH）D3水平低可明显增加心脏病(心肌梗死、心力衰竭等)死亡率，糖尿病患者也普遍缺乏VD(达91%)，病情恶化也和血液中25（OH）D3降低相关。综合分析世界上各国流行病学研究资料，同样发现25（OH）D3低下患者还易患各种自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、多发性硬化症、红斑狼疮等。在动物实验和少数临床预防性试验中发现，VD可以预防自身变态反应性疾病的发生。维生素D不仅在维护骨骼健康中起作用，而且在非骨骼疾病中起潜在作用，如自体免疫疾病、癌症、心理健康问题和心血管疾病等。当需要快速矫正维生素D缺乏，如患者有疾病症状、或准备开始高效抗吸收药物治疗（唑来膦酸Zoledronate或狄诺塞麦Denosumab），推荐的治疗方案是在固定负荷剂量的基础上，随后规则维持治疗。在我国，维生素D缺乏性佝偻病目前仍是婴幼儿的常见病，因维生素D缺乏引起体内钙、磷代谢失常，导致长骨干骺端和骨组织矿化不全，以致骨骼发生病变。维生素D缺乏还可影响神经、肌肉、造血、免疫等组织器官的功能对小儿的健康危害较大。因此，积极预防维生素D缺乏及维生素D缺乏性佝偻病，是儿科医疗保健工作者的重要任务。为了更好地开展维生素D缺乏及维生素D缺乏性佝偻病的防治工作，全国佝偻病防治科研协作组和中国优生科学协会小儿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1）样品提取：取设定量的血清放置于离心管中，再向离心管中加入沉淀蛋白破坏剂以破坏血清中的沉淀蛋白从而使得25（OH）D3从沉淀蛋白中释放出，将血清样品与沉淀蛋白破坏剂混合均匀后再瞬离至少一次，从而获得含有25（OH）D3、磷脂和蛋白质的混合物样品；/n步骤2）上样：将步骤1）中所获得混合物样品上样到硅藻土萃取板，待全部的混合物样品浸入至硅藻土萃取板后静置，该硅藻土萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；/n步骤3）洗脱：对硅藻土萃取板进行至少一次的洗脱处理，洗脱结束后，将硅藻土萃取板与收集板整体上下叠合，然后压合硅藻土萃取板和收集板从而使得收集板收集含有25（OH）D3的洗脱液；/n步骤4）复溶：以气体吹收集板至洗脱液的溶剂蒸发而剩下存留在收集板的孔内的25（OH）D3的萃取物，向收集板的孔内加入复溶剂对萃取物进行复溶，从而获得25（OH）D3的复溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1）样品提取：取设定量的血清放置于离心管中，再向离心管中加入沉淀蛋白破坏剂以破坏血清中的沉淀蛋白从而使得25（OH）D3从沉淀蛋白中释放出，将血清样品与沉淀蛋白破坏剂混合均匀后再瞬离至少一次，从而获得含有25（OH）D3、磷脂和蛋白质的混合物样品；
步骤2）上样：将步骤1）中所获得混合物样品上样到硅藻土萃取板，待全部的混合物样品浸入至硅藻土萃取板后静置，该硅藻土萃取板至少吸附混合物样品中的磷脂和蛋白质；
步骤3）洗脱：对硅藻土萃取板进行至少一次的洗脱处理，洗脱结束后，将硅藻土萃取板与收集板整体上下叠合，然后压合硅藻土萃取板和收集板从而使得收集板收集含有25（OH）D3的洗脱液；
步骤4）复溶：以气体吹收集板至洗脱液的溶剂蒸发而剩下存留在收集板的孔内的25（OH）D3的萃取物，向收集板的孔内加入复溶剂对萃取物进行复溶，从而获得25（OH）D3的复溶液。


2.根据权利要求1所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：所述步骤1）中，取100-200μL血清样品加入至离心管中，再向离心管中加入100-300μL体积比为50:50的水/异丙醇混合液作为沉淀蛋白破坏剂破坏血清中的沉淀蛋白，在2500-3000rpm转速下涡旋混合均匀，并且以7000-12000rpm转速瞬离10-50s；优选的，在第一次瞬离结束后，至少再向离心管内再加入100-300μL50:50的水/异丙醇混合液，并且在2500-3000rpm转速下涡旋至少1min，而后均匀混合后在7000-12000rpm转速下瞬离10-50s。


3.根据权利要求2所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：所述步骤2）中，将所述步骤1）中所获得混合物样品上样到400-500μL/mL的硅藻土萃取板中，待全部的混合物样品浸入至硅藻土萃取板后静置3-6min。


4.根据权利要求3所述的血清中维生素D代谢物-25（OH）D3的提取方法，其特征在于：所述步骤3）中，用异辛烷或正己烷对硅藻土萃取板进行洗脱处理，分三次进行洗脱，最后一次洗脱结束后，以正压装置压合上下叠合的硅藻土萃取板和收集板；优选的，正压装置的开启压力为10-15psi，压合时间为5-8s；优选的，采用1.2-2.1mL异辛烷或正己烷对硅藻土萃取板进行洗脱处理。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅强，谢利德，程亚美，丁浩，
申请(专利权)人：苏州康吉诊断试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32