本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系，包括以下步骤：抗生素卡那霉素适宜浓度筛选；菌液的制备；预培养；侵染；共培养；筛选培养；抗性苗获得；转基因植株的PCR检测。本发明专利技术以细叶百合无菌小鳞片为转化材料，通过对农杆菌转化过程中的主要转化条件进行优化，建立了一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系，将绿色荧光蛋白基因GFP转入细叶百合，转化率达到16.13％。其优势在于以细叶百合鳞片为转化受体的直接再生途径，再生率高，变异率和假阳性率低，转化周期短，约3.5个月即可获得完整植株，转化率高，为百合的分子育种、种质资源创制及品种改良奠定基础。
An Agrobacterium mediated transformation system of Lily scales
【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系
本专利技术涉及生物
的百合遗传转化方法，具体涉及一种以鳞片为转化受体，建立农杆菌介导的细叶百合高效遗传转化体系的方法。
技术介绍
细叶百合(Liliumpumilum)又名山丹，原产于中国北方寒冷地区，花瓣向外反卷，花色鲜红，观赏价值极高，可直接应用于园林景观中；并且具有较强的抗旱、抗寒、抗盐碱的能力，是百合抗性育种的重要亲本。近几年来，对于细叶百合的研究主要集中在杂交育种以及分类学上，而关于其基因工程方面的研究少有报道。采用常规的育种技术来改良植物的品种不仅耗时费力，并且难度大，而利用基因工程手段，向植物中导入外源目的基因，是快速有效改良植物品种的重要途径，具有广泛的发展前景。因此，通过基因工程来培育细叶百合新品种，对于园林发展具有重要的意义。用于百合转基因的方法主要是农杆菌介导法与基因枪法，相比于后者，由于农杆菌可以引起植物发生可遗传变异、拷贝数少、插入位点固定、后代遗传简单等优点，农杆菌介导法常被采用。但百合是单子叶植物，利用农杆菌介导法进行基因转化，可能会出现一些问题，如对农杆菌具有不敏感性、T-DNA整合不稳定、转化植株性状遗传稳定性差等。目前仅有少数农杆菌介导百合转化成功的研究报道，离实用化阶段仍有一定的距离，因此，建立高效的百合遗传转化体系具有重要的意义。
技术实现思路
针对已有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化的方法。包括Kan(卡那霉素)对细叶百合鳞片最适筛选浓度，农杆菌侵染过程中的最适菌液浓度、侵染时间、AS(乙酰丁香酮)用量的研究。为了实现上述目的，本专利技术采取如下技术解决方案：1、抗生素敏感性试验将切成0.5cm2大小的细叶百合小鳞片接种于添加不同浓度Kan的培养基(MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+400mg/LCef)上进行培养，定期观察小鳞片的生长状态并统计褐化率，确定Kan对小鳞片的最适筛选浓度为120mg/L。2、细叶百合遗传转化条件优化采用农杆菌介导法，在不同转化条件下，经农杆菌侵染并抗性筛选的细叶百合小鳞片，40d后统计抗性芽产生率，比较并确定最适的遗传转化条件：农杆菌菌液浓度为OD600＝0.7，侵染时间为15min，侵染液及共培养基中所加AS浓度为20mg/L。3、侵染液的制备将含有绿色荧光蛋白基因GFP的农杆菌菌液在YEP+50mg/LKan+100mg/LRif的固体培养基上划线，28℃下暗培养48h后，挑取长势较好的单菌落，接种于10mL附加50mg/LKan和100mg/LRif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养24h后，从中吸取菌液按1:100的比例加入到50ml含有50mg/LKan和100mg/LRif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.7。将活化后的菌液4500rpm离心10min，弃去上清，用含有20mg/LAS的1/2MS(不含NH4NO3)液体培养基(PH＝5.7)悬浮菌体沉淀，200rpm震荡1.5-2h，即为转化用的侵染液。4、预培养将细叶百合小鳞片切成0.5cm2大小，放在预培养基(MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)上，25℃暗培养3d。5、侵染将预培养后的细叶百合小鳞片放在已制备好的侵染液中侵染15min，期间不断轻轻震荡，使侵染液与小鳞片充分接触，取出后置于无菌的滤纸上吸干表面附着的菌液。6、共培养将侵染后的细叶百合小鳞片接种在共培养基[MS(不含NH4NO3)+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+20mg/LAS]上，25℃黑暗培养3d。7、筛选培养将共培养后的细叶百合小鳞片接种在筛选培养基(MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+120mg/LKan+400mg/LCef)上光照培养，进行抗性筛选，每隔2周转接到新的相同培养基上，期间剔除褐化的小鳞片。8、抗性苗获得待筛选出的细叶百合小鳞片长出1cm左右的不定芽时，将不定芽切下并转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/LIBA+100mg/LKan+400mg/LCef)上诱导生根，每隔3周转接到新的相同培养基上，期间剔除白化的小苗，得到抗性苗。9、PCR检测以细叶百合总DNA为模板，对获得的抗性苗进行PCR检测，如果得到与目的基因绿色荧光蛋白基因GFP大小一致的条带，则说明目的基因已整合到转基因细叶百合基因组中。步骤3所述的农杆菌为EH105农杆菌，含植物表达载体PBI121，携带有抗卡那霉素基因nptⅡ和绿色荧光蛋白基因GFP。本专利技术具有的有益效果：1、本专利技术采用农杆菌介导法，将绿色荧光蛋白基因GFP转入细叶百合，通过对Kan筛选浓度确定及农杆菌菌液浓度、侵染时间、AS用量等侵染条件的优化，建立了农杆菌介导的细叶百合鳞片高效稳定的遗传转化体系，为百合的分子育种、种质资源创制及品种改良奠定基础。2、本专利技术选用细叶百合无菌小鳞片为转化材料，其优势在于百合鳞片的直接再生能力强，通过诱导直接分化出不定芽形成再生植株，避免再生过程中发生变异，再生率高，假阳性率低，且缩短了周期，约3.5个月即可获得完整植株，从而提高了遗传转化效率。附图说明图1为抗性筛选过程中产生的褐化小鳞片；图2为筛选的抗性芽；图3为生根筛选过程中产生的白化苗；图4为生根的抗性芽；图5为获得的抗性植株；图6为转基因植株PCR检测结果；图中，M：Marker(DL2000)；菌：阳性对照；水、WT：阴性对照；1-5：转基因细叶百合。具体实施方式通过以下实施例对农杆菌介导的细叶百合鳞片遗传转化体系的构建做进一步说明。实施例中所用根癌农杆菌菌株为EHA105，含植物表达载体PBI121，携带有绿色荧光蛋白基因GFP。1、抗生素敏感性试验将切成0.5cm2大小的细叶百合小鳞片接种于添加不同浓度Kan(0、100、110、120、130mg/L)的培养基(MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+400mg/LCef)上进行培养，定期观察小鳞片的生长状态并统计褐化率，确定Kan对小鳞片的最适筛选浓度。表1Kan浓度筛选从表1可以看出，kan对小鳞片的分化产生了抑制作用。在不含kan的培养基中，小鳞片的褐化率为0；在kan浓度为110mg/L时，褐化率上升至82％；当kan浓度为120mg/L时，小鳞片全部褐化死亡。因此，选择120mg/L的kan浓度作为小鳞片最终的筛选浓度。2、侵染液的制备将含有绿色荧光蛋白基因GFP的农杆菌菌液在YEP+50mg/LKan+100mg/LRif的固体培养基上划线，28℃下暗培养48h后，挑取长势较好的单菌落，接种于10mL附加50mg/LKan和100mg/LRif的YEP液体培养基中，2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系，包括以下步骤：/n(1)抗生素敏感性试验/n将切成0.5cm
【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的细叶百合鳞片高效遗传转化体系，包括以下步骤：
(1)抗生素敏感性试验
将切成0.5cm2大小的细叶百合小鳞片接种于添加不同浓度Kan(卡那霉素)的培养基(MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+400mg/LCef)上进行培养，定期观察小鳞片的生长状态并统计褐化率，确定Kan对小鳞片的最适筛选浓度为120mg/L。
(2)细叶百合遗传转化条件优化
采用农杆菌介导法，在不同转化条件下，经农杆菌侵染并抗性筛选的细叶百合小鳞片，40d后统计抗性芽产生率，比较并确定最适的遗传转化条件：农杆菌菌液浓度为OD600＝0.7，侵染时间为15min，侵染液及共培养基中所加AS(乙酰丁香酮)浓度为20mg/L。
(3)侵染液的制备
将含有绿色荧光蛋白基因GFP的农杆菌菌液在YEP+50mg/LKan+100mg/LRif的固体培养基上划线，28℃下暗培养48h后，挑取长势较好的单菌落，接种于10mL附加50mg/LKan和100mg/LRif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养24h后，从中吸取菌液按1:100的比例加入到50ml含有50mg/LKan和100mg/LRif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.7。将活化后的菌液4500rpm离心10min，弃去上清，用含有20mg/LAS的1/2MS(不含NH4NO3)液体培养基(PH＝5.7)悬浮菌体沉淀，200rpm震荡1.5-2h，即为转化用的侵染液。
(4)预培养
将细叶百合小鳞片切成0.5cm...
【专利技术属性】
技术研发人员：张彦妮，刘彬，王营，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23
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