棉花基因叠加目标系的建立及其应用制造技术

本发明专利技术公开了棉花起始目标系的获得及其应用方法，含有attP、Lox重组位点的起始目标系通过目标载体转化棉花下胚轴，分子分析及BLAST定位分析获得了有利于目的基因叠加的4个棉花起始目标系的基因组位点。本发明专利技术公开的4个适合棉花基因定点叠加的基因组位点，有利于将相关功能基因通过位点特异性重组定点叠加在该基因位点处，不仅可以直接减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系渗入当地大田品种过程中的工作量，而且几乎不影响其他基因的正常表达。

Establishment and application of cotton gene superposition target line

【技术实现步骤摘要】
棉花基因叠加目标系的建立及其应用
本专利技术属于生物
，特别涉及棉花起始目标系的建立及其应用。
技术介绍
现有技术中，转基因一直通过传统的育种方法导入商业品种。但不同品种间的杂交可导致许多重要的农艺性状基因变成杂合状态。对于育种来说，一个育种品系性状必须要纯合，不仅是转基因性状，也包括与大田优良品种相关的所有其他优良性状。对于二倍体和类似二倍体的异源多倍体植物而言，在没有遗传连锁的情况下，通过分离获得n个独立性状的纯合株系的比例是(1/4)n。例如，要获得6个优良性状和1个转基因性状的纯合株系的概率为(1/4)7，但如果再添加3个转基因位点，那么获得纯合株系的比例为(1/4)10，需要在超过1,000,000个单株中才有可能筛选到纯合株系。自然地，回交越多，选出只占极少数比例的纯合体就越耗时耗力。对于大量区域性品种的选育及其相应的田间试验而言，增加分离的转基因位点的数量促使转基因作物改良的成本更高，时间更长。为了保持单个转基因位点，现有技术将新的基因和之前导入的基因体外结合重构进行新一轮转化，再通过筛选单拷贝获得植物株系。如果之前导入性状较少，这种“重头来做”的方式值得考虑。但当商业品种已有许多转基因性状时，每增加一个新的性状，重新进行基因工程和重新释放之前的性状会变得更困难。通常，避免多个分离位点的问题可通过直接转化优良品种来解决。这可省去育种过程，也可加速新转基因品种的开发。然而，多数商业品种的遗传转化更难转化，需要大量的投入才能获得足够的可大田评估的独立转化事件。更麻烦的是从监管角度而言，即使是同样的DNA的个体转化，不同品种都被认为是不同事件，释放评估要分别进行。而对一个整合事件渗入不同品种情况则被认为是同一个事件。我们已经报道过一种在植物体内进行基因叠加的方法，该策略可以将一个新的基因定点整合在已有的转基因位点之后(Houetal.,2014)。该方法可以通过分支杆菌噬菌体Bxb1-att位点特异性整合酶系统将含转基因的质粒定点整合到基因组重组位点，其中，Bxb1(整合酶)重组酶在不含其它蛋白质和高能辅助因子的作用下可以催化48bp的attP位点和38bp的attB位点发生重组，产生attL和attR位点(Ghoshetal.,2003)。Bxb1整合酶介导定点整合后不需要的DNA可以通过来源于大肠杆菌噬菌体P1中的Cre-lox重组系统删除，其中Cre蛋白能够使同向的34bplox位点间发生重组。原则上，每个整合载体都会带入新的重组位点(attP或attB)用于下一轮整合，因此该叠加系统可无限地进行下去。为使该基因叠加系统可操作，首先必须要有一个目标植株系(起始系)，该目标系必须含有一个位点，由attP或attB序列组成，从而允许整合酶Bxb1催化位点特异性重组，实现目的基因的定点整合。为使该基因叠加系统可操作，首先必须要有一个起始目标系。该目标系基因组中必须设置一个重组位点(attP或attB序列)(起始位点)，从而允许通过整合酶Bxb1催化此位点进行特异性重组，实现定点整合。同时，为了适宜于整合基因的表达和后续的育种，这个起始位点需要插入到基因组的适宜位置上：(1)报告基因gfp表达良好；(2)单拷贝；(3)非着丝粒近处；(4)没有插入或靠近已知基因；(5)重组位点完整。在本工作中我们描述了适于籼稻的基因叠加系统的建立。棉花是我国重要经济作物，基因工程是遗传改良的一个重要途径。然而，其遗传转化是一瓶颈，周期长(平均1年获得转化苗)，效率低(平均～5％)。因此根据现有技术，本专利技术致力于建立一种适用于目的基因定点整合的棉花起始目标系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于目的基因定点整合的棉花起始目标系。本专利技术的进一步目的在于提供棉花起始目标系定点整合的方法。为了在棉花中实现精确、高效的多基因聚合，本专利技术将重组酶Bxb1和Cre介导的基因定点整合系统应用到在棉花作物中。本专利技术通过农杆菌转化法将含有attP、lox重组酶位点、筛选标记基因表达盒及报告基因表达盒的目标系载体转入棉花，进行分子分析及基因组插入位点分析，获得4个适于目的基因定点整合的棉花起始目标系；并在两个起始目标系中进行了功能基因定点整合，初步证明该系统在棉花中可行性及有效性。本专利技术所采取的技术方案是：棉花基因组位点在插入棉花叠加载体中的应用，该棉花基因组位点为：1)棉花基因组Scalfold1148.1的第345,872位碱基和第345,904碱基位之间；2)棉花染色体8的第75,355,569位碱基和第75,355,618位碱基之间；3)棉花染色体12的第59,038,164位碱基和第59,038,179位碱基之间；4)棉花染色体9的第45,024,430位碱基和第45,025,368位碱基之间；基因组信息参考陆地棉TM-1。一种建立棉花起始目标系的方法，包括以下步骤：农杆菌介导法转化含有attP、lox重组酶位点，gfp报告基因表达盒，筛选标记基因nptII表达盒以及RS2重组酶位点的目标载体，并获得转基因植株；检测上述转基因植株T-DNA左右边界完整性，转基因片段在基因组中的插入位点，获得棉花起始目标系；构建含有attB、lox重组酶位点和目的基因的叠加载体；将叠加载体和Bxb1重组酶DNA共转化棉花起始目标系胚性愈伤；获得目的基因定点整合植株。进一步的，所述attP重组位点为Mycobacteriumsmegmati噬菌体Bxb1整合酶识别的attP重组位点。进一步的，所述同向的attP和attB重组位点用于通过Bxb1整合酶将1个或多个目的基因DNA定点整合到棉花基因组目标位点。进一步的，所述lox重组酶位点能够被来源于bacteriophageP1的Cre重组酶识别。进一步的，所述RS2重组位点为Acetinetobacter质粒中能被重组酶CinH识别的RS2重组位点。棉花基因组中适合上述目的基因定点整合的棉花起始目标株系，T-DNA插入基因组的位点包括以下4个：1)棉花基因组Scalfold1148.1的第345,872位碱基和第345,904碱基位之间；2)棉花染色体8的第75,355,569位碱基和第75,355,618位碱基之间；3)棉花染色体12的第59,038,164位碱基和第59,038,179位碱基之间；4)棉花染色体9的第45,024,430位碱基和第45,025,368位碱基之间；基因组信息参考陆地棉TM-1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/？org＝gossypium-hirsutum&group＝malvids)。本专利技术的有益效果：1)棉花遗传转化普遍困难，平均转化率5％左右。本专利技术将含有attP、lox重组位点的目标载体转化棉花下胚轴，通过分子及BLAST定位分析获得了有利于目的基因定点整合的4个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.棉花基因组位点在插入棉花叠加载体中的应用，其特征在于，该棉花基因组位点为：/n1)棉花基因组Scalfold1148.1的第345,872位碱基和第345,904碱基位之间；/n2)棉花染色体8的第75,355,569位碱基和第75,355,618位碱基之间；/n3)棉花染色体12的第59,038,164位碱基和第59,038,179位碱基之间；/n4)棉花染色体9的第45,024,430位碱基和第45,025,368位碱基之间；基因组信息参考陆地棉TM-1。/n

【技术特征摘要】
1.棉花基因组位点在插入棉花叠加载体中的应用，其特征在于，该棉花基因组位点为：
1)棉花基因组Scalfold1148.1的第345,872位碱基和第345,904碱基位之间；
2)棉花染色体8的第75,355,569位碱基和第75,355,618位碱基之间；
3)棉花染色体12的第59,038,164位碱基和第59,038,179位碱基之间；
4)棉花染色体9的第45,024,430位碱基和第45,025,368位碱基之间；基因组信息参考陆地棉TM-1。


2.一种建立棉花起始目标系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
农杆菌介导法转化含有重组酶位点attP和lox，gfp报告基因表达盒，筛选标记基因nptII表达盒以及RS2重组酶位点的目标载体，并获得转基因植株；
检测上述转基因植株T-DNA左右边界，转基因片段在基因组中的插入位点，获得用于目的基因叠加的棉花起始目标系；
构建含有attB、lox重组酶位点和目的基因的叠加载体；
将叠加载体和Bxb1重组酶DNA共转化起始目标株系胚性愈伤；
获得目的基因定点整合到起始目标系的植株。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述attP重组位点为...

【专利技术属性】
技术研发人员：区永祥，李如玉，李亚梅，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44