一种利用大肠杆菌发酵制备L-苯丙氨酸的方法技术

本发明专利技术属于微生物技术生产医药中间体技术领域，公开了一种利用大肠杆菌发酵制备L‑苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1)制备大肠杆菌种子液，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）制备代谢调节物，步骤4）发酵产L‑苯丙氨酸。本发明专利技术方法针对代谢途径进行了优化，提高了L‑苯丙氨酸的发酵产量；使用的原料易得，环境友好性强。

A method of producing L-phenylalanine by E.coli fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种利用大肠杆菌发酵制备L-苯丙氨酸的方法
本专利技术属于微生物技术生产医药中间体
，具体涉及一种利用大肠杆菌发酵制备L-苯丙氨酸的方法。
技术介绍
苯丙氨酸系统命名为“2-氨基苯丙酸”，是α-氨基酸的一种，具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）比旋光度为-35.1°，pI=5.48。苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一，常温下为白色结晶或结晶性粉末固体，溶于水，难溶于甲醇、乙醇、乙醚。苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一，属芳香族氨基酸。在体内大部分经苯丙氨酸羟化酶催化作用氧化成酪氨酸，并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素，参与机体糖代谢和脂肪代谢。L-苯丙氨酸是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人体和动物不能靠自身自然合成的必需氨基酸之一，是复配氨基酸输液的重要成份；复合氨基酸输液国内近几年发展很快，已由单纯营养型发展到治疗型，用于肝、肺、脑、肾、婴儿生长不良，代血浆和癌症的辅助治疗等；用于医药，是苯丙氨苄、甲酸溶肉瘤素等氨基酸类抗癌药物的中间体，也是生产肾上腺素、甲状腺素和黑色素的原料药；已有研究表明，L-苯丙氨酸可作为抗癌药物的载体将药物分子直接导入癌瘤区，其效果是其他氨基酸的3～5倍。自1879年发现并从羽扇豆中分离得到苯丙氨酸后，苯丙氨酸的制备方法不断得到改进。L-苯丙氨酸可由天然蛋白质水解法、酶法、化学合成法、发酵法得到。目前工业化生产路线主要为发酵法和酶法，化学合成法应用也较广泛。天然蛋白质水解法是最早应用于获得L-苯丙氨酸的方法，主要通过水解大豆获得，但是大豆中L-苯丙氨酸含量较低，生产分离提纯较为复杂和困难，生产成本高，难以大规模推广使用。酶法具有产物浓度高，纯化步骤少，生产能力强等优点，缺点是原料和酶的价格较高。化学合成法会产生大量的副产物和废水废气，在合成L-苯丙氨酸过程中，需要综合考虑原料的来源、价格以及合成工艺条件实现的难易程度，各步反应生成副产物的多少、收率的高低以及对环境的影响程度等诸多因素。L-苯丙氨酸的发酵法是一种利用微生物发酵合成L-苯丙氨酸的的方法，这种方法可以克服化学法和酶法合成L-苯丙氨酸的缺陷，绿色环保，而且能耗低，可持续发展性强。发酵法由于使用的菌种、原料以及发酵培养条件的不同，最终发酵液中L-苯丙氨酸的含量差异很大，要想获得苯丙氨酸的高效率，主要对菌株代谢途径进行调控。文献1“大肠杆菌产L-苯丙氨酸发酵调控及代谢通量分析，中国生物工程杂志2015年”考察了外源添加中间代谢产物、维生素B1和硫酸镁对大肠杆菌发酵产L-苯丙氨酸的影响，结果表明，添加柠檬酸三钠、a-酮戊二酸、维生素B1及硫酸镁均L-苯丙氨酸的合成有利，副产物乙酸的产量降低了50%以上。根据构建的大肠杆菌合成L-苯丙氨酸的生化反应网络，利用代谢通量分析其原因，结果表明，这些物质的添加均可以调节代谢通量分布，为L-苯丙氨酸的合成提供更多的前体物质。文献2“重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸培养基的优化，微生物学通报2015年”使用正交试验设计以及响应面优化法分别对种子培养基及发酵培养基进行优化，确定了重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe的最佳种子培养基及最佳发酵培养基。通过正交试验和响应面分析对重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe培养基进行优化，明显提高了L-Phe的产量，并确定了葡萄糖、玉米浆和硫酸铵为发酵培养基中影响L-Phe产量的3个关键因子。在最佳培养基条件下L-Phe产量最高达到9.14g/L，较优化前的7.46g/L提高了22.5%,研究结果为L-Phe的发酵放大提供了依据。不同的菌株代谢途径有所差异，无法照搬，需要根据具体所选菌株的代谢途径进行优化，以提升L-苯丙氨酸的产量。如何针对菌体发酵条件进行优化，以提高L-苯丙氨酸的生产效率是我们需要解决的技术问题。
技术实现思路
为了克服现有技术中微生物发酵合成L-苯丙氨酸工艺存在的缺陷，本专利技术提供了一种利用大肠杆菌发酵生产苯丙氨酸的方法，该方法针对代谢途径进行了优化，提高了L-苯丙氨酸的发酵产量。本专利技术方法使用的原料易得，环境污染较小。为了实现本专利技术所带来的技术效果，本专利技术采用如下的技术方案。一种利用大肠杆菌发酵制备L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1)制备大肠杆菌种子液，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）制备代谢调节物，步骤4）发酵产L-苯丙氨酸。进一步地，所述方法包括如下步骤：步骤1)制备大肠杆菌种子液：以产L-苯丙氨酸的大肠杆菌进行活化，然后接种到一级种子培养基、二级种子培养基中进行扩大培养，得到大肠杆菌种子液；步骤2）制备发酵培养基：取各原料：葡萄糖，玉米浆，磷酸二氢钾，碳酸钙，柠檬酸三钠，色氨酸，酪氨酸，七水硫酸镁，维生素B1以及三氯化镧，pH控制在6.5-7.0，灭菌；步骤3）制备代谢调节物：将丙二酸钠或/和丙氨酸添加无菌水中，搅拌均匀；步骤4）发酵产L-苯丙氨酸：将大肠杆菌种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养24h，然后进行超声处理，再添加占发酵液体积10-20%的步骤3）所述的代谢调节物，并继续发酵培养20-30h，停止发酵。进一步地，所述步骤2）制备发酵培养基，包括：按照如下配比浓度取各原料：葡萄糖80g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾5g/L，碳酸钙2g/L，柠檬酸三钠1g/L，色氨酸0.5g/L，酪氨酸0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，维生素B10.01g/L，三氯化镧0.005g/L，pH控制在6.8，在115℃下灭菌15min，自然冷却即得。进一步地，所述步骤3）制备代谢调节物，包括：将丙二酸钠和丙氨酸添加无菌水中，搅拌均匀。进一步地，所述步骤4）中发酵培养的条件为：转速为200rpm，溶氧量为15%，温度为34℃，罐压为0.05MPa；发酵过程中，通过流加氨水控制pH值在6.8，通过流加葡萄糖溶液控制残糖浓度为1g/L，直至发酵结束。进一步地，所述超声处理的参数为：功率为500W，超声频率为20KHz，振幅为60%，超声总时间为5min，每次超声时间为30s，间隔时间为90s。优选地，所述一级和二级种子培养基的组分均为：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化镁0.2g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，一水硫酸锰0.005g/L，pH控制在6.8，在115℃下灭菌15min。优选地，所述丙二酸钠和丙氨酸的浓度分别为5g/L和10g/L。本专利技术取得的有益效果主要包括以下几个方面：L-苯丙氨酸代谢涉及多个代谢通路和中间代谢物，需要考虑多个因素进行调控，以使得前体物质更多地应用于生成目的产物，并且提高底物的利用度。PEP流向Pyr的代谢流过大时，流向L-苯丙氨酸合成途径的代谢流变小，而流向HMP途径的代谢流量超过代谢能力时，会使代谢流更多地流向副产物，造成副产物的积累；因此，需要增加PEP流向L-苯丙氨酸代谢途径的代谢流。通过加入丙氨酸，对丙酮酸激酶有变构抑制作用，减少PEP流向Pyr的代谢本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用大肠杆菌发酵制备L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1)制备大肠杆菌种子液，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）制备代谢调节物，步骤4）发酵产L-苯丙氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用大肠杆菌发酵制备L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1)制备大肠杆菌种子液，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）制备代谢调节物，步骤4）发酵产L-苯丙氨酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1)制备大肠杆菌种子液：以产L-苯丙氨酸的大肠杆菌进行活化，然后接种到一级种子培养基、二级种子培养基中进行扩大培养，得到大肠杆菌种子液；
步骤2）制备发酵培养基：
取各原料：葡萄糖，玉米浆，磷酸二氢钾，碳酸钙，柠檬酸三钠，色氨酸，酪氨酸，七水硫酸镁，维生素B1以及三氯化镧，pH控制在6.5-7.0，灭菌；
步骤3）制备代谢调节物：将丙二酸钠或/和丙氨酸添加无菌水中，搅拌均匀；
步骤4）发酵产L-苯丙氨酸：
将大肠杆菌种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养24h，然后进行超声处理，再添加占发酵液体积10-20%的步骤3）所述的代谢调节物，并继续发酵培养20-30h，停止发酵。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2）制备发酵培养基，包括：按照如下配比浓度取各原料：葡萄糖80g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾5g/L，碳酸钙2g/L，柠檬酸三钠1g/L，色氨酸0.5g/L，酪氨酸0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，维生素B10.01g/L，三氯化镧0.005g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘加林，霍萧勇，刘加海，方朝杰，张渊源，
申请(专利权)人：杭州巴洛特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33