短链脂肪酸的定量方法技术

一种短链脂肪酸的定量方法，使用3‑硝基苯肼作为衍生化试剂对生物排泄样本中的短链脂肪酸进行衍生化，以生成在紫外光区有特征吸收峰的短链脂肪酸衍生化产物，利用HPLC‑UV法并基于分配色谱法原理在紫外光区下测定短链脂肪酸衍生化产物，从而实现对短链脂肪酸的定量检测。本发明专利技术的短链脂肪酸的定量方法的准确度、精密度高、检测限低。

Quantitative method of short chain fatty acids

【技术实现步骤摘要】
短链脂肪酸的定量方法
本专利技术涉及定量检测
，尤其涉及一种短链脂肪酸的定量方法，具体利用高效液相色谱法(HPLC-UV)对被处理过和/或未被处理过的生物排泄样本(具体可采用人体粪便和/或粪便发酵液)中10种短链脂肪酸进行定量分析，属于内源性物质检测技术方法。
技术介绍
短链脂肪酸又称为挥发性脂肪酸，多是由肠道内厌氧菌发酵未消化吸收的食物残渣中碳水化合物而产生的有机脂肪酸，包含乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和异己酸等。短链脂肪酸的种类、含量主要取决于肠道内菌群种类、宿主食物中的纤维含量以及消化的时间等。肠道中短链脂肪酸多数以离子形式存在，主要通过转运体吸收利用。乙酸可被宿主吸收利用，提供人体日总能量的约10％；丙酸经血液吸收后在肝脏中分解代谢，参与丙酮酸逆转化为葡萄糖的过程，同时可能抑制脂肪的合成；丁酸主要被上皮细胞利用。肠道短链脂肪酸参与肠上皮细胞的能量供应，可影响肠腔pH和电解质平衡、肠黏膜屏障的通透性和肠道高敏感等，与肠道相关疾病有一定关系。最新研究发现，短链脂肪酸对肿瘤细胞的增殖能起到抑制作用，并诱导肿瘤细胞的分化和凋亡，降低癌变的机率。因其在维持机体正常生理功能中具有重要作用，因此定量检测正常生理状态及病理状态下肠道及粪便中该类物质的含量具有重要意义。目前，生物样品中的短链脂肪酸的定量方法有很多，包括气相色谱(GC-FID)、气质联用(GC-MS)，液质联用(LC-MS)等方法；其中GC-FID及GC-MS是最常用的测定方法，GC测定法多采用乙醚萃取和衍生化进行分析，或用乙醚直接萃取后采用FFAP极性柱直接测定样品中的短链脂肪酸。专利CN105021726A将粪便样品以蒸馏水均质处理后直接进行GC-FID测定，然而该方法仅测定了6种短链脂肪酸，并未能对其他含量较少的短链脂肪酸进行测定；且人体粪便样品的色谱图基线不稳定，各短链脂肪酸分离效果较差。专利CN104807933A采用乙醇萃取后用GC-MS对乳品中的短链脂肪酸进行检测，该方法采用DB-FFAP极性色谱柱对乙醇提取液进行分离；然而该方法由于前处理过程中引入酸的原因，提取的短链脂肪酸可能会与乙醇反应，导致短链脂肪酸定量结果不准确。专利CN105651908A，利用饱和食盐水配制的盐酸溶液酸化，乙酸乙酯萃取及N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺MTBSTFA衍生化后用气相色谱-质谱联用仪定量检测小鼠肠道内容物和粪便样品中11种短链脂肪酸；该方法虽然准确度、精密度高，但是检测费用昂贵，并不适用于大部分检测机构和实验室。综上，目前仍缺少适用性强、准确度高、精密度高且检测限低的短链脂肪酸检测方法。因此，建立一种适用性强、准确度高且检测限低的生物排泄样本中短链脂肪酸含量的测定方法是很有必要的。但到目前为止，还没有搜索到类似的检测方法；特别是采用目前最为普通的HPLC-UV检测粪便或粪便发酵液中短链脂肪酸的方法尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题，提出一种短链脂肪酸的定量方法。本专利技术所提出的技术方案如下：本专利技术提出了一种短链脂肪酸的定量方法，使用3-硝基苯肼作为衍生化试剂对生物排泄样本中的短链脂肪酸进行衍生化，以生成在紫外光区有特征吸收峰的短链脂肪酸衍生化产物，利用HPLC-UV法并基于分配色谱法原理在紫外光区下测定短链脂肪酸衍生化产物，从而实现对短链脂肪酸的定量检测。本专利技术上述的短链脂肪酸的定量方法中，包括以下步骤：步骤S1、收集生物排泄样本；按照预设比例采用乙腈萃取该生物排泄样本中的短链脂肪酸，从而得到萃取液；在萃取液中加入3-硝基苯肼、EDC和吡啶以使萃取液中的短链脂肪酸衍生化，从而得到短链脂肪酸衍生化产物；步骤S2、将短链脂肪酸衍生化产物上样于活化的SPE小柱，得到上样后的SPE小柱；对上样后的SPE小柱进行水洗脱除杂，再利用预设第一体积的甲醇水溶液进行洗脱，从而得到第一洗脱液，然后利用预设第二体积的纯甲醇进行洗脱，从而得到第二洗脱液，实现SPE分段洗脱；分别对第一洗脱液和第二洗脱液进行干燥，然后采用甲醇定容，再离心，取上清液，从而分别得到第一待分析液和第二待分析液；步骤S3、采用HPLC-UV法并基于分配色谱法原理在紫外光区分别测定第一待分析液和第二待分析液中的短链脂肪酸衍生化产物，从而实现对短链脂肪酸的定量检测。本专利技术上述的短链脂肪酸的定量方法中，所述甲醇水溶液的浓度采用35wt％。本专利技术上述的短链脂肪酸的定量方法中，步骤S3包括：步骤S31、分别取第一待分析液和第二待分析液进行HPLC-UV检测；其中，HPLC条件为：色谱柱：C18色谱柱，流动相A为0.1～0.2v/v％的甲酸水溶液；流动相B为乙腈；流动相A的比例为84～50wt％，流动相B的比例为16～50wt％；检测波长：355nm；进样量为10～30μL，流速为1mL/min；步骤S32、基于分配色谱法原理分别测定第一待分析液和第二待分析液中的短链脂肪酸衍生化产物。本专利技术上述的短链脂肪酸的定量方法中，步骤S32包括：通过对比步骤S31中HPLC-UV检测的结果，并将其与短链脂肪酸标准品衍生化后的保留时间及其紫外特征吸收图谱对照，利用紫外特征吸收波长及相应化合物的保留时间对第一待分析液和第二待分析液中的短链脂肪酸衍生化产物进行定性分析；选择355nm波长下对所需测定的短链脂肪酸特征吸收峰进行积分，以短链脂肪酸特征吸收峰的峰面积为纵坐标y，短链脂肪酸浓度为横坐标x绘制曲线；通过绘制所得的曲线即可分别计算得到生物排泄样本经SPE分段洗脱所得到的第一洗脱液和第二洗脱液中10种短链脂肪酸的浓度，从而计算得到生物排泄样本中10种短链脂肪酸定量检测结果。本专利技术上述的短链脂肪酸的定量方法中，所述的10种短链脂肪酸为：乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸、3-甲基戊酸、异己酸以及己酸。本专利技术上述的短链脂肪酸的定量方法中，步骤S31中HPLC-UV检测的梯度洗脱程序如下：本专利技术上述的短链脂肪酸的定量方法中，在所述步骤S2中，第一洗脱液和第二洗脱液通过氮气吹干。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术的短链脂肪酸的定量方法的准确度、精密度高、检测限低，且可以同时定量检测10种短链脂肪酸。(2)本专利技术的短链脂肪酸的定量方法，检测方便，检测成本低廉，适用性强，可满足大部分实验室对人体粪便及粪便发酵液中短链脂肪酸的检测需求。(3)粪便中浓度较高的短链脂肪酸有乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸等，而戊2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸、3-甲基戊酸、异己酸和己酸等因在粪便中浓度较低，采用非MS方法一般难以检测定量，但本专利技术能同时对人体粪便及粪便发酵液样品中含量较高和含量较低短链脂肪酸的进行检测定量，有助于分析比较正常和病理状态下肠道内主要短链脂肪酸的代谢规律，评价肠道微生态平衡，为与肠道相关疾病的研究提供重要依据。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中：图1为10种短链本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种短链脂肪酸的定量方法，其特征在于，使用3-硝基苯肼作为衍生化试剂对生物排泄样本中的短链脂肪酸进行衍生化，以生成在紫外光区有特征吸收峰的短链脂肪酸衍生化产物，利用HPLC-UV法并基于分配色谱法原理在紫外光区下测定短链脂肪酸衍生化产物，从而实现对短链脂肪酸的定量检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种短链脂肪酸的定量方法，其特征在于，使用3-硝基苯肼作为衍生化试剂对生物排泄样本中的短链脂肪酸进行衍生化，以生成在紫外光区有特征吸收峰的短链脂肪酸衍生化产物，利用HPLC-UV法并基于分配色谱法原理在紫外光区下测定短链脂肪酸衍生化产物，从而实现对短链脂肪酸的定量检测。


2.根据权利要求1所述的短链脂肪酸的定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、收集生物排泄样本；按照预设比例采用乙腈萃取该生物排泄样本中的短链脂肪酸，从而得到萃取液；在萃取液中加入3-硝基苯肼、EDC和吡啶以使萃取液中的短链脂肪酸衍生化，从而得到短链脂肪酸衍生化产物；
步骤S2、将短链脂肪酸衍生化产物上样于活化的SPE小柱，得到上样后的SPE小柱；对上样后的SPE小柱进行水洗脱除杂，再利用预设第一体积的甲醇水溶液进行洗脱，从而得到第一洗脱液，然后利用预设第二体积的纯甲醇进行洗脱，从而得到第二洗脱液，实现SPE分段洗脱；分别对第一洗脱液和第二洗脱液进行干燥，然后采用甲醇定容，再离心，取上清液，从而分别得到第一待分析液和第二待分析液；
步骤S3、采用HPLC-UV法并基于分配色谱法原理在紫外光区分别测定第一待分析液和第二待分析液中的短链脂肪酸衍生化产物，从而实现对短链脂肪酸的定量检测。


3.根据权利要求2所述的短链脂肪酸的定量方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的浓度采用35wt％。


4.根据权利要求3所述的短链脂肪酸的定量方法，其特征在于，步骤S3包括：
步骤S31、分别取第一待分析液和第二待分析液进行HPLC-UV检测；
其中，HPLC条件为：色谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹华强，董婷霞，王怀友，汪成，
申请(专利权)人：香港科技大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44