本发明专利技术提供了一种大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒。该技术方案针对大豆过敏原基因GlymBd 28K和核桃过敏原基因jug r1设计特异性的探针和引物，组成大豆核桃二重荧光定量PCR引物和探针组合，该试剂盒可对两种过敏原成分同时实现检测作用。在此基础上，本发明专利技术通过构建大豆核桃过敏原基因标准质粒，优化二重荧光定量PCR反应体系以及引物探针浓度、退火温度优化，构建标准曲线，分别进行特异性试验、重复性试验和敏感性试验，对本发明专利技术的检测效果进行了验证。本发明专利技术提供的试剂盒具有高效、快速、特异性好等特点，能在1～2h之内得出结果，满足快速检测食品中大豆核桃过敏原的要求。
Double fluorescence quantitative PCR detection kit for allergen gene of soybean walnut
【技术实现步骤摘要】
大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒
本专利技术涉及分子生物学和核酸检测
，进一步涉及基于基因检测技术的食物过敏原检测试剂盒，具体涉及一种大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒。
技术介绍
近几年来，由于过敏性疾病发病率的增加和转基因技术的发展、转基因农作物的商品化等因素，人们开始重新评价食物过敏带来的问题，食物过敏对大众健康的影响也才开始受到重视，成为一种全球关注的公共卫生问题。实验室中用来鉴别致敏成分的常用方法主要是基于酶联免疫吸附实验(ELISA)和PCR反应。在食品安全方面，ELISA技术已广泛应用于兽药残留、农药残留、动植物疫情、有害微生物、动植物毒素等方面的快速检测分析，并取得了较好的效果。随着人们对食品过敏认识的深入和重视程度的加强，越来越多的ELISA技术已被开发出来，用于食品中致敏原蛋白提取物和特殊食品致敏原的检测和定量分析。此外，致敏物质的DNA分子可以通过PCR技术来扩增，在PCR过程中DNA分子的引物也得到了扩增。产物即可利用分子量的大小在琼脂糖电泳上进行分离。一般来说，选择合适的引物可使具有一定同源性的DNA分子之间的交叉反应降低到最低程度，尽可能地减少假阳性结果的产生。PCR技术的这一特点使得它在检测致敏物质方面相对于其他检测方法具有很大的优势。国际上，对食品致敏成分的研究从上个世纪80年代开始越来越受到人们的关注。而且各国政府和机构也越来越重视在食品标签上标注致敏成分。欧盟联合法律EC89/2003规定，在其管辖范围内出售的含有花生、坚果、鸡蛋、牛奶、甲壳类、鱼类、芝麻、含麸质谷类、大豆、芹菜、芥末、每千克或每升在10毫克以上的硫碘氧化物和亚硫酸盐的食品都必须在其产品标签中标明。除食品法典委员会所确定的八类致敏原物质及10mg/kg以上的亚硫酸盐外，还包括芹菜、羽扇豆、软体动物及这几类产品致敏原标签和消费者保护方案，规定所有在美国销售的包装食品必须符合有关食品致敏原标注要求，其中致敏原主要指：牛奶、蛋、鱼类、甲壳贝类、坚果类、小麦、花生、大豆等8种成分；其它国家包括韩国、日本、加拿大、澳大利亚也都要求在其本国销售的食品标签中标注其中所含有的致敏成分。我国虽然研究食品致敏成分的工作开展得相对较晚，但随着经济发展水平和人们生活水平的提高，以及人们对饮食和健康的重视，食品致敏成分的研究工作得以顺利开展而且取得了很大的进展。而且，自我国加入WTO以来，国际化进程的加速也对我国在食品安全方面提出了更高的要求，因此我国先后颁布了一些相关的国家标准和地方标准，包括中华人民共和国出入境检验检疫行业标准、北京市标准化指导性技术文件、广州市地方技术规范及中华人民共和国国家标准。为了能够有效检测食品中的致敏成分，避免因为没有发现或标注不完善而引发的食物过敏现象，各国先后发展了免疫印迹法、ELISA法、PCR法、等离子共振免疫法等实验室方法用于检测食物致敏原，并逐步建立了可以用于检测食品中的花生、面筋、大豆、鱼、虾等致敏原的检测方法。然而，现有方法在检测效果方面存在着不同程度的缺陷。其中，部分方法以蛋白作为检测目标，由于在产品加工过程中蛋白易遭到破坏，因此导致此类方法的可靠性难以保证；相对于蛋白而言，DNA性质比较稳定，以其作为检测目标更加可靠，因此PCR法在此方面具有一定的优势，然而，选择何种基因作为检测目标，采用怎样的检测方法才能保证检测的特异性和灵敏性，现有技术尚未获得理想的解决方案。此外，在目前的检测技术中，无法在一个反应体系中检测两种过敏原，使得针对多种过敏原的检测只能分别进行。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，以解决现有技术中缺乏此类试剂盒的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是，如何在一个反应体系中同时检测大豆过敏原、核桃过敏原两种成分。本专利技术要解决的再一技术问题是，对基于基因检测的核桃过敏原成分检测试剂盒，如何充分保证其特异性和灵敏性。本专利技术要解决的又一技术问题是，对基于基因检测的大豆过敏原成分检测试剂盒，如何充分保证其特异性和灵敏性。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括用于扩增大豆基因GlymBd28K的引物及用于标记大豆基因GlymBd28K的探针，还包括用于扩增核桃基因jugr1的引物及用于标记核桃基因jugr1的探针。作为优选，所述用于扩增大豆基因GlymBd28K的引物分别是序列为GCTGCAGATAACGTGAAG和CTAGCGGAAAGGAGATTG的核苷酸片段，所述用于标记大豆基因GlymBd28K的探针是序列为CTCTGACCTTCTCCTATGTTCACCAA的核苷酸片段。作为优选，所述用于扩增核桃基因jugr1的引物分别是序列为AGTGCATATTTCATACCTTTC和CGATCTCCATGGTTGTTA的核苷酸片段，用于标记核桃基因jugr1的探针是序列为CAATGACCAGGCTCGCAACTC的核苷酸片段。作为优选，该试剂盒包括以下反应体系：TaqPremixExTaqTM(ProbeqPCR)(2×Conc.)10μL，用于扩增大豆基因GlymBd28K的上游引物0.5μL，用于扩增大豆基因GlymBd28K的下游引物0.5μL，用于标记大豆基因GlymBd28K的探针0.25μL，用于扩增核桃基因jugr1的上游引物0.5μL，用于扩增核桃基因jugr1的下游引物0.5μL，用于标记核桃基因jugr1的探针0.25μL，模板1μL，灭菌水补齐至20μL。作为优选，所述模板为待测样本的DNA；该试剂盒还包括用于提取待测样品DNA的提取试剂。作为优选，所述模板为大豆标准质粒和核桃标准质粒。作为优选，所述大豆标准质粒是通过以下方法构建的：取大豆植株的新鲜叶片，提取总DNA，以其为模板PCR扩增大豆GlymBd28K基因，扩增产物经分离纯化后加一个粘性末端A尾，而后与pMD18-T载体连接，而后将连接产物转入感受态的大肠杆菌E.coliDH5α中，从菌液中提取质粒，经鉴定得到所述大豆标准质粒。作为优选，所述以其为模板PCR扩增大豆GlymBd28K基因，此过程所采用的上下游引物分别是序列为CTAGAAACATTGGAAACACC的核苷酸片段和序列为ATCACATACCCTCAAGACAT的核苷酸片段；此过程的PCR反应体系为：上、下游引物各1μL，提取的植物DNA模板1μL，primerSTARGXL酶0.5μL，5×buffer5μL，dNTP1μL，ddH2O补齐至25μL。作为优选，所述核桃标准质粒是通过以下方法构建的：取核桃植株的新鲜叶片，提取总DNA，以其为模板PCR扩增核桃jugr1基因，扩增产物经分离纯化后加一个粘性末端A尾，而后与pMD18-T载体连接，而后将连接产物转入感受态的大肠杆菌E.coliDH5α中，从菌液中提取质粒，经鉴定得到所述核桃标准质粒。作为优选，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括用于扩增大豆基因GlymBd 28K的引物及用于标记大豆基因GlymBd 28K的探针，还包括用于扩增核桃基因jug r 1的引物及用于标记核桃基因jug r 1的探针。/n
【技术特征摘要】
1.大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括用于扩增大豆基因GlymBd28K的引物及用于标记大豆基因GlymBd28K的探针，还包括用于扩增核桃基因jugr1的引物及用于标记核桃基因jugr1的探针。
2.根据权利要求1所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述用于扩增大豆基因GlymBd28K的引物分别是序列为GCTGCAGATAACGTGAAG和CTAGCGGAAAGGAGATTG的核苷酸片段，所述用于标记大豆基因GlymBd28K的探针是序列为CTCTGACCTTCTCCTATGTTCACCAA的核苷酸片段。
3.根据权利要求2所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述用于扩增核桃基因jugr1的引物分别是序列为AGTGCATATTTCATACCTTTC和CGATCTCCATGGTTGTTA的核苷酸片段，用于标记核桃基因jugr1的探针是序列为CAATGACCAGGCTCGCAACTC的核苷酸片段。
4.根据权利要求3所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下反应体系：TaqPremixExTaqTM(ProbeqPCR)(2×Conc.)10μL，用于扩增大豆基因GlymBd28K的上游引物0.5μL，用于扩增大豆基因GlymBd28K的下游引物0.5μL，用于标记大豆基因GlymBd28K的探针0.25μL，用于扩增核桃基因jugr1的上游引物0.5μL，用于扩增核桃基因jugr1的下游引物0.5μL，用于标记核桃基因jugr1的探针0.25μL，模板1μL，灭菌水补齐至20μL。
5.根据权利要求4所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述模板为待测样本的DNA；该试剂盒还包括用于提取待测样品DNA的提取试剂。
6.根据权利要求4所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述模板为大...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏嘉，丁功涛，兰海鸥，马忠仁，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。