一株含群体感应淬灭基因aiiA的蜡样芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开一株含群体感应淬灭基因

【技术实现步骤摘要】
一株含群体感应淬灭基因aiiA的蜡样芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及植物病害生物防治
，具体涉及一株含群体感应淬灭基因aiiA的蜡样芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
作物青枯病是一种典型的细菌性的维管束植物病害，也是世界上分布最广、危害最重、造成损失最大的毁灭性病害之一，主要分布在热带、亚热带及温带地区。该病的病原菌为青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum），该病菌的寄主范围十分广泛，能侵染包括烟草、马铃薯、甘薯、桉树、罗汉果等在内的54个科，450多种植物。目前该病尚无比较有效的防治手段，主要采用的防治方法有种植抗病品种、化学防治、农业防治和生物防治等。虽然化学防治有一定效果，但由于多耐药细菌的出现以及化学药剂带来的生态安全、农药残留等问题，因而急需寻找化学防治有效的替代方法，因而近年来生物防治成为研究热点。大量研究证明，许多植物细菌与细菌之间存在着信息交换，它们在生长过程中自身能够分泌出一种信号分子，随着信号分子的不断增加，当达到一定临界值时，细菌中的相关调控因子启动相关基因的表达来适应不断变化的环境，这种现象被称为群体感应（quorum-sensing，QS）系统。许多细菌的重要生物学功能都受到QS系统的调控，包括参与某些色素的产生、某些抗生素的合成、生物群游现象等，其中引起人们重点研究的是参与动植物致病因子的表达。在大部分革兰氏阴性细菌中是以N-酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserinelactones，AHL）作为信号分子来调控许多病原菌致病基因的表达，因此AHL信号分子可作为防治植物细菌病害的新靶标位点，这种对细菌QS调控机制的干扰和破坏称为群体感应淬灭(Quorumquenching,QQ)。如果破坏细菌中的AHL信号可抑制QS系统的调控，这样其相对应的细菌生物学功能基因就会受到抑制，已有研究发现，芽孢杆菌属(Bacilllus)中含有N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(autoinducerinactivationgene，aiiA基因)，它所编码的AiiA蛋白能水解欧文氏菌(Erwinia)产生的AHLs信号分子的内酯环，使其失活，抑制了致病基因的诱导表达，降低了病原菌的致病性；因而含有aiiA基因的生防细菌对具有AHL的群体感应调控系统的植物病原细菌具有抑制作用，而作物青枯病菌和西瓜细菌性果斑病菌菌均具有AHL的群体感应调控系统，这使得通过干扰致病菌QS系统，使其信号分子在细胞环境中的浓度难以被致病菌感应系统感知而抑制致病因子表达，从而达到抑制病原菌的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株含群体感应淬灭基因aiiA的蜡样芽孢杆菌及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：所述的含群体感应淬灭基因aiiA的蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）BC15，已于2019年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019346，保藏地址为武汉大学。所述含有aiiA猝灭基因蜡样芽孢杆菌BC15的筛选方法，包括以下步骤：（1）aiiA基因的引物：aiiA1F：5’-ATGACAGTAAARAARCTTTATTTC-3’aiiA1R：5’-CTATATATAYTCHGGGAACRCTYTA-3’（2）PCR扩增：以aiiA1F和aiiA1R为引物，BC15菌株的总DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。（3）防治效果测定：烟草青枯病是一种典型的土传病害，因此采用菌液灌根法进行盆钵防治效果测定实验，22d防治效果依然可达到60.82%。（4）BC15菌株的形态和生理生化特征鉴定：BC15菌株在NA培养基上菌落呈圆形，白色，表面有光泽且粗糙，革兰氏染色呈阳性，菌体为杆状；该菌株可利用淀粉、七叶灵、阿拉伯糖、丙三醇、海藻糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、纤维二糖、麦芽糖和木糖，不能利用丙二酸盐、糖醇和香叶醇，耐盐性为7%，接触酶测定为阴性。本专利技术的优点在于：①本专利技术的蜡样芽孢杆菌BC15是含有群体感应淬灭基因aiiA的生防菌株，其本身在平板上对作物青枯病菌和西瓜细菌性果斑病菌没有抑制作用，但盆钵和果实离体防治实验中却具有一定的防治效果，这为防治作物青枯病和西瓜细菌性果斑病提供了一个新的策略。②本专利技术的蜡样芽孢杆菌BC15对烟草青枯病菌、番茄青枯病和马铃薯青枯病均具有一定的防治作用，其中对烟草青枯病接种后22d防效依然可达60.82%，优于对照化学药剂氢氧化铜；对西瓜果实细菌性果斑病接种后10d的防效为70.86%，与化学农药相比无污染、无残留、无毒害，对环境有较高的安全性，是一个绿色防控措施，对作物细菌性病害的防治具有重要的意义。附图说明图1菌株BC15aiiA基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图。图2菌株BC15对烟草青枯病的防治效果图。A:无菌水；B:青枯菌；C:BC15。图3菌株BC15对西瓜细菌性果斑病的防治效果图。图4菌株BC15的菌落形态图。图5菌株BC15的革兰氏染色图。图6菌株BC15的16SrDNA和gyrB基因扩增电泳图，其中1为BC15，2为无菌水。图7菌株BC15的16SrDNA系统发育进化树图。图8菌株BC15的gyrB系统发育进化树图。具体实施方式实施例1从福建福州金山采集的健康西瓜果实上分离获得的。即取西瓜果实组织1.0g，用70%酒精浸泡30s，置于1%次氯酸钠水溶液中消毒4min，取出植物组织用无菌水冲洗3次。样品晾干后分别置于无菌研钵中加5mL无菌水研磨成浆状，静置15min后，取上层澄清液50μL涂布在NA培养基（牛肉膏3g；蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂18-20g，蒸馏水1L，pH7.2），28℃黑暗培养48h，挑取其中的一个单菌落纯化后保存，即为本专利技术的蜡样芽孢杆菌，命名为BC15。BC15菌株的形态和生理生化特征鉴定：BC15菌株在NA培养基上菌落呈圆形，白色，表面有光泽且粗糙，革兰氏染色呈阳性，菌体为杆状；该菌株可利用淀粉、七叶灵、阿拉伯糖、丙三醇、海藻糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、纤维二糖、麦芽糖和木糖，不能利用丙二酸盐、糖醇和香叶醇，耐盐性为7%，接触酶测定为阴性。实施例3蜡样芽孢杆菌BC15aiiA基因扩增采用菌落PCR法提取BC15的基因组为模板，扩增aiiA基因。aiiA基因扩增引物序列（aiiA1F：5’-ATGACAGTAAARAARCTTTATTTC-3’；aiiA1R：5’-CTATATATAYTCHGGGAACRCTYTA-3’）。PCR扩增条件为：预变性94℃，4min；变性94℃，1min；退火48℃，45s；延伸72℃，50s；后延伸72℃，5min，30个循环。结果可获得一条大小为的750bp特异性条带。见图1。实施例4蜡样芽孢杆菌BC15的分子生物学鉴定（1）设计16SrDNA通用引物（27F-M13F(-4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株含群体感应淬灭基因

【技术特征摘要】
1.一株含群体感应淬灭基因aiiA的蜡样芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）BC15，已于2019年5月10日保藏于中国典型培养物保藏...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡学清，胡宇如，郑钰婷，胡方平，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35