用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法技术

本发明专利技术属于去泛素化酶荧光检测技术领域，具体涉及一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法。将介孔硅纳米颗粒分散在含有菲啰啉‑硅的二氯甲烷溶液中反应，得到介孔硅‑菲啰啉纳米颗粒；介孔硅‑菲啰啉纳米颗粒与TbCl

Preparation of Nanofluorescent probe for the detection of ubiquitinase

【技术实现步骤摘要】
用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法
本专利技术属于去泛素化酶荧光检测
，具体涉及一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法。
技术介绍
泛素是一种由76个氨基酸组成的小蛋白。泛素化是泛素在一系列特异性酶的作用下特异性修饰靶蛋白的过程，调节蛋白质活性。在泛素化过程中，通过在泛素的C-末端和目标蛋白的内切酶之间形成等肽键而与目标蛋白结合。去泛素化酶能催化肽键的水解，从而调节靶蛋白的泛素化状态。所以泛素化可以通过去泛素化酶的作用来逆转。一大类去泛素化酶调节这种细胞过程，并且在癌症、传染病和神经退行性疾病等多种疾病中起着重要作用。因此实现去泛素化酶的高灵敏度检测对诸多疾病的预测和治疗具有重要的科学意义。为了监测去泛素化酶的活性，研究者开发了诸多方法，如质谱、免疫印迹和光致发光。其中，发光检测因其灵敏度高、实验方便而被证明是一种强有力的手段。基于镧系离子(Eu3+、Tb3+和其他配合物)的荧光探针在检测阳离子、阴离子和有机小分子方面表现出极好的灵敏度，它们有尖锐的发射带和较大的斯托克位移。然而，由于竞争配位作用，镧系元素探针的荧光在水中和生物溶剂中很容易熄灭。镧系元素传感系统的荧光强度也会受到配位环境的影响。限域效应可以改变稀土配合物的振动频率，影响能量传递的类型。因此，适当的限域条件可以防止荧光分子振动，使能量主要以荧光信号的形式发射。目前，介孔二氧化硅纳米颗粒易于控制尺寸限制，是构建增强荧光强度的受限环境的最佳材料。故如何构建限域环境下荧光增强的高选择性和灵敏度的纳米探针是本领域技术人员的研究热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，制备方法简单，制备周期短，制得的纳米荧光探针稳定性好，使用方便，具有高选择性、较高的检测灵敏度和较好的准确性。本专利技术所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：(1)将介孔硅纳米颗粒分散在含有菲啰啉-硅的二氯甲烷溶液中反应，得到介孔硅-菲啰啉纳米颗粒；(2)介孔硅-菲啰啉纳米颗粒与TbCl3·6H2O在乙醇中混合，回流，加入1,3-二苯基-1,3-丙二酮反应，得到纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb)；(3)将纳米荧光探针前驱体悬浮在聚乙烯亚胺水溶液中进行聚乙烯亚胺涂覆，得到聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb-PEI)；(4)聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在混合溶液中，搅拌，得到纳米荧光探针(MSN-Tb-UbR)；步骤(4)中所述的混合溶液的制备方法是将EDC和NHS溶解在含有标记有罗丹明B的泛素的磷酸缓冲液中，搅拌活化，得到混合溶液。步骤(1)中所述的菲啰啉-硅的制备方法是1，10-菲啰啉-5-胺与异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌，除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物搅拌反应后，加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将浅黄色沉淀溶解在甲醇中并过滤，除去甲醇，并加入冷己烷重新沉淀，得到菲啰啉-硅。步骤(1)中所述的菲啰啉-硅的制备方法具体是0.5-1.5mmol1，10-菲啰啉-5-胺与1.2-2.2mL异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌1-60min，10-35℃下真空除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物在60-100℃下再搅拌10-48小时，反应后，向混合物中加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将沉淀物溶解在甲醇中并过滤，通过蒸发除去甲醇，并使用冷己烷重新沉淀产物(菲啰啉-硅)，将制备的菲啰啉-硅在40-80℃下真空干燥。步骤(1)中所述的菲啰啉-硅与二氯甲烷的配比为2-10:10，菲啰啉-硅以mg计，二氯甲烷以mL计。步骤(1)中所述的介孔硅纳米颗粒与菲啰啉-硅的质量比为200-700:2-10。步骤(1)中所述的反应温度为50-100℃，反应时间为2-20h。步骤(2)中所述的TbCl3·6H2O与菲啰啉-硅的质量比为2-20:2-10。步骤(2)中所述的TbCl3·6H2O与乙醇的配比为2-20:5-50，TbCl3·6H2O以mg计，乙醇以mL计。步骤(2)中所述的回流温度为60-100℃，回流时间为1-3h。步骤(2)中所述的1,3-二苯基-1,3-丙二酮与菲啰啉-硅的质量比为10-80:2-10。步骤(2)中所述的反应温度为60-100℃，反应时间为2-30h。步骤(3)中所述的纳米荧光探针前驱体与聚乙烯亚胺(PEI)水溶液的配比为80-120:10-100，纳米荧光探针前驱体以mg计，聚乙烯亚胺水溶液以mL计。步骤(3)中所述的聚乙烯亚胺水溶液的浓度为1-20wt％。步骤(4)中所述的聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体与混合溶液的配比为5-100：8-12，聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体以mg计，混合溶液以mL计。步骤(4)中所述的搅拌温度为20-30℃，搅拌时间为20-30小时。步骤(4)中所述的混合溶液的制备方法具体是将0.05-0.3mmolEDC和0.1-0.4mmolNHS溶解在含有5-100μM标记有罗丹明B的泛素(Ub-R)的5-20mL磷酸缓冲液(pH7.4)中，在15-35℃下搅拌10-30分钟以活化Ub-R的羧基，得到混合溶液。通过本专利技术所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法制备得到的纳米荧光探针主要用于去泛素化酶(UCH-L1)的检测。本专利技术制备得到的纳米荧光探针在545nm处的荧光较弱，580nm处的荧光较强，当加入UCH-L1反应后，545nm处的荧光增强，580nm处的荧光减弱。本专利技术通过在负载Tb3+配合物的介孔二氧化硅纳米粒子表面修饰标记有罗丹明B的泛素(Ub-R)，得到纳米荧光探针(MSN-Tb-UbR)。纳米荧光探针被紫外激发时会发生从Tb3+向罗丹明B的荧光共振能量转移，加入UCH-L1后，荧光共振能量转移被切断，Tb3+的荧光增强，罗丹明B的荧光减弱，从而实现对UCH-L1的检测。本专利技术所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，包括如下具体步骤：(1)将菲啰啉-硅溶解在二氯甲烷中，制得溶液A；(2)将介孔硅纳米颗粒分散在溶液A中，搅拌，氮气保护，50-100℃反应2-20h，过滤收集，乙醇漂洗，真空干燥，得到混合物B；(3)将TbCl3·6H2O与混合物B在乙醇中混合，回流，得到混合物C；(4)将1,3-二苯基-1,3-丙二酮与混合物C反应2-30h，冷却，过滤，沉淀，乙醇洗涤，真空干燥，得到混合物D；(5)将混合物D悬浮在1-20wt％的聚乙烯亚胺水溶液中进行聚乙烯亚胺涂覆，室温下搅拌2-30h后，用去离子水冲洗，得到混合物E；(6)将EDC和NHS溶解在含有标记有罗丹明B的泛素的磷酸缓冲液中，搅拌活化，得到混合溶液，然后将混合物E分散于混合溶液中，在20-30℃下搅拌20-30小时，产物通过离心机收集。步骤(6)中标记有罗丹明B的泛素通过聚乙烯亚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)将介孔硅纳米颗粒分散在含有菲啰啉-硅的二氯甲烷溶液中反应，得到介孔硅-菲啰啉纳米颗粒；/n(2)介孔硅-菲啰啉纳米颗粒与TbCl

【技术特征摘要】
1.一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将介孔硅纳米颗粒分散在含有菲啰啉-硅的二氯甲烷溶液中反应，得到介孔硅-菲啰啉纳米颗粒；
(2)介孔硅-菲啰啉纳米颗粒与TbCl3·6H2O在乙醇中混合，回流，加入1,3-二苯基-1,3-丙二酮反应，得到纳米荧光探针前驱体；
(3)将纳米荧光探针前驱体悬浮在聚乙烯亚胺水溶液中进行聚乙烯亚胺涂覆，得到聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体；
(4)聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在混合溶液中，搅拌，得到纳米荧光探针；
步骤(4)中所述的混合溶液的制备方法是将EDC和NHS溶解在含有标记有罗丹明B的泛素的磷酸缓冲液中，搅拌活化，得到混合溶液。


2.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的菲啰啉-硅的制备方法是1，10-菲啰啉-5-胺与异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌，除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物搅拌反应后，加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将浅黄色沉淀溶解在甲醇中并过滤，除去甲醇，并加入冷己烷重新沉淀，得到菲啰啉-硅。


3.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的菲啰啉-硅与二氯甲烷的配比为2-10:10，菲啰啉-硅以mg计，二氯甲烷以mL计；介孔硅纳米颗粒与菲啰啉-硅的质量比为200-700:2-10。


4.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王粤博，梁妍妍，王怀松，崔辉，艾兵，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东;37