一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种主动免疫调控微粒，包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP1多肽、SYNZIP2多肽、核酸分子CpG、T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP2多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术中的主动免疫调控微粒可以克服肿瘤微环境的免疫抑制环境，打破免疫耐受，提高整个免疫系统对肿瘤抗原的免疫应答，快速高效的激活肿瘤特异性B细胞和T细胞的免疫反应杀伤肿瘤，通过细胞因子的刺激还可以促进免疫细胞的扩增。以通过皮下注射的方式给药，并且可以通过毛细血管被动靶向到肿瘤组织内部，迅速的被免疫细胞和肿瘤细胞内吞。

An active immunomodulatory microparticle and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用
本专利技术涉及疫苗制剂领域，特别是涉及一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用。
技术介绍
治疗性疫苗(TherapeuticVaccine)是近年建立和发展起来的肿瘤免疫治疗新概念，是指能够打破慢性感染者体内免疫耐受，重建或增强免疫应答的疫苗。肿瘤治疗性疫苗的基本原理是通过靶向肿瘤相关或肿瘤特异性的抗原肽，提升免疫系统对于含此类抗原肽的癌细胞的识别与杀伤能力。具体步骤包括以下四步：1)外源抗原进入机体后，被抗原呈递细胞(APC)以胞吞形式摄入，进而在胞内被水解为能与MHC-I或MHC-II类分子结合的抗原肽片段；2)通过MHC将抗原肽递呈至APC表面，形成pMHC复合物；3)通过与pMHC-TCR的互作，被MHC-II类分子呈递的抗原肽可激活CD4+T细胞，释放多种细胞因子促使相关免疫细胞的活化和增殖，被MHC-I类分子呈递的抗原肽可激活CD8+T细胞；4)CD8+T细胞在pMHCI-TCR和CD4+Th细胞的共同刺激下进一步分化形成细胞毒性淋巴细胞(CTL)，通过分泌穿孔素等细胞毒素直接杀伤靶细胞，从而实现消除肿瘤的作用。根据肿瘤疫苗的来源，可分为肿瘤细胞疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、树突状细胞疫苗等，根据作用机制不同治疗性疫苗可分为两类，一类是通过产生效应细胞起作用，如产生特异性杀伤性T细胞，用于肿瘤治疗或是清除病毒(HBV、HCV、HIV、HPV等)感染细胞；另一类是通过诱导体内产生抗体起作用，抗体可以结合活性分子进而封闭活性分子的功能，抗体还可以通过补体及ADCC效应杀伤肿瘤细胞。肿瘤疫苗作为肿瘤免疫治疗的一个分支，相对于传统肿瘤治疗“杀敌一千自损八百”的方式，肿瘤疫苗能在有效避免健康细胞损伤的前提下激活免疫系统，具有很好的开发前景。肿瘤免疫疗法相比于传统疗法，具有独特的优势。由于免疫疗法的机制在于激活自身的免疫系统，识别并清除肿瘤细胞，因此一旦起效，患者将有可能获得动态的、持续的抗肿瘤免疫反应，肿瘤复发率低，甚至对于晚期癌症可实现临床治愈。目前治疗性疫苗存在的技术问题：1、内源性蛋白作为抗原产生的抗体起效慢、滴度低，一般的肿瘤疫苗其发挥疗效一般需要3-4个月的时间，且有可能需要进行多次免疫，发挥作用所需的周期太长，并且刺激产生的特异性抗体滴度过低。2、刺激产生的抗体特异性差，3，肿瘤免疫耐受的问题。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用，用于解决现有技术中疫苗的抗肿瘤效果不佳的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供第一方面提供一种主动免疫调控微粒，所述主动免疫调控微粒包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP1多肽、SYNZIP2多肽、核酸分子CpG、T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP1多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述SYNZIP2多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术第二方面提供主动免疫调控微粒的制备方法，至少包括如下步骤：1)制备SYNZIP2-CpG-微载体颗粒；2)将SYNZIP1分别与T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原连接，获得连接物I、连接物II和连接物III；3)将连接物I、连接物II和连接物III和SYNZIP2-CpG-微载体颗粒混合，获得所述主动免疫调控微粒。本专利技术第三方面提供前述主动免疫调控微粒在制备细胞因子促进剂或恶性实体瘤治疗药物中的用途。如上所述，本专利技术的一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用，具有以下有益效果：本专利技术中的主动免疫调控微粒融合了多种免疫刺激分子和免疫细胞靶向分子，本专利技术中的主动免疫调控微粒可以克服肿瘤微环境的免疫抑制环境，打破免疫耐受，提高整个免疫系统对肿瘤抗原的免疫应答，快速高效的激活肿瘤特异性B细胞和T细胞的免疫反应杀伤肿瘤。同时本专利技术中还融合了细胞因子IL-15，除了可以激活免疫细胞外，通过细胞因子的刺激还可以促进免疫细胞的扩增。最后本专利技术中的免疫微球是纳米级别的，可以通过皮下注射的方式给药，并且可以通过毛细血管被动靶向到肿瘤组织内部，迅速的被免疫细胞和肿瘤细胞内吞。总之，本专利技术克服了目前肿瘤治疗性疫苗的缺点，综合了目前已有的细胞治疗，抗体治疗和治疗性疫苗的诸多有点，开发而成的全新一代主动免疫治疗剂。附图说明图1：主动免疫调控微粒模式图。图2：模拟的多肽SYNZIP1/SYNZIP2三维结构图3：纯化后的SYNZIP-1-FcOP蛋白电泳图。图4：IL-15-SYNZIP1纯化后的蛋白电泳图。图5：显微镜下的主动免疫治疗性纳米微球PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20图6：PBMC对免疫微球的内吞作用。图7：不同浓度的免疫微球刺激后细胞因子分泌情况。具体实施方式本专利技术旨在克服目前肿瘤免疫治疗中的缺点，综合目前肿瘤免疫治疗的优点，设计出了一种主动免疫调控微粒，通过激活机体的免疫系统，刺激机体快速产生特异性的免疫反应，同时激活体液免疫和细胞免疫，既可以产生特异性的抗体，也可以产生针对肿瘤特异性杀伤T细胞。本专利技术中的主动免疫调控微粒以具有优异的生物相容性和可降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA)为基本骨架，其粒径约为200nm,易穿透血管内皮细胞(肿瘤内皮间隙为200-780nm)到达靶组织，淋巴细胞大部分直径为6-8um，易于被淋巴细胞吞噬。在该纳米颗粒中包含了新型的免疫增强剂CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(Oligodeoxy-nucleotidescontainingCpGmotifs，CpGODN)，IL-15细胞因子，特异性靶向免疫细胞的优化后的抗体片段(FcOP)，以及肿瘤新抗原，本专利技术中通过在微球中融合一段SYNZIP1/2螺旋拉链结构多肽，通过SYNZIP1/2天然的组成二聚体、将IL-15、优化后的Fc片段和肿瘤新抗原的氨基酸片段偶联到纳米免疫微球表面，制备的微球可以根据治疗的需要通过螺旋拉链结构的自组装获得不同的主动免疫调控的纳米微球，该主动免疫调控剂主要用于基于新抗原治疗的恶性实体瘤的治疗。以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。此外应理解，本专利技术中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本专利技术中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种主动免疫调控微粒，其特征在于，所述主动免疫调控微粒包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP1多肽、SYNZIP2多肽、核酸分子CpG、T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP2多肽的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种主动免疫调控微粒，其特征在于，所述主动免疫调控微粒包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP1多肽、SYNZIP2多肽、核酸分子CpG、T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP1多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述SYNZIP2多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。


2.如权利要求1所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，所述SYNZIP1多肽和SYNZIP2多肽组成二聚体。


3.如权利要求2所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，所述T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原通过所述二聚体分别偶联到所述微载体上。


4.如权利要求3所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，所述T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原分别与所述二聚体中的SYNZIP1多肽相连，所述微载体与所述二聚体中的SYNZIP2多肽相连。


5.如权利要求1所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述T细胞促进剂选自IL-15、IL-2中的一种或多种；
2)所述抗体Fc段的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；
3)所述抗原为肿瘤新抗原，所述肿瘤新抗原是指肿瘤细胞所特有的抗原；
4)所述二聚体连接于所述微载体表面；
5)所述核酸分子CpG负载于所述载体内部；
6)所述微载体选自PLGA；
7)所述主动免疫调控微粒粒径为198.8-201.8nm。


6.如权利要求5所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列选自SEQIDNO：4-7中的任一种或多种。


7.一种主动免疫调控微粒的制备方法，至少包括如下步骤：
1)制备SYNZIP2-CpG-微载体颗粒；
2)将SYNZIP1分别与T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原连接，...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪健，梁辉，崔大祥，
申请(专利权)人：优锐生物医药科技深圳有限公司，上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44