一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于生物样本中极性和弱极性代谢物同时提取的方法，在待分析的生物样本中对极性和弱极性代谢物进行选择性富集。分别收集富含极性代谢物的上层和富含弱极性代谢物的下层，上层直接于nano‑LC‑MS非靶向分析多肽组，下层经干燥复溶后于LC‑MS非靶向分析弱极性代谢物和靶向分析诸如类固醇激素类成分的物质。本发明专利技术的优点在于可以通过少量生物样品一次性提取尽可能多的极性和弱极性代谢物，并进行非靶向和靶向代谢组分析，节约了生物样本用量，极性代谢物组和弱极性代谢物组来自同一样本，两者之间的相对重复性好于多次提取，便于多平台分析的数据整合。

【技术实现步骤摘要】
一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法
本申请涉及分析化学领域，具体涉及一种在生物样本中同时提取极性和弱极性代谢物并进行基于液相色谱-质谱联用的极性和弱极性代谢物分析的方法。
技术介绍
生物体的代谢紊乱涉及众多疾病的发生发展，基于液相色谱-质谱联用的非靶向和靶向代谢组分析是研究疾病代谢标志物的重要手段。生物样本组成成分复杂，尤其是血浆含有高丰度蛋白质干扰物；在人体活体检查时获得的生物样本量有限，常用的小鼠模型可得到的血浆和组织样本亦很少；且极性和弱极性代谢物极性差异较大，使得同时提取较困难，分别提取的方法消耗生物样本量较大，且两者之间的相对重复性较差，不利于多平台分析的数据整合。因此需要在实际的代谢物组学分析中采用一种高效、节省组织用量的同时提取极性和弱极性代谢物组的提取方法。目前，有机溶剂(甲醇、乙腈、丙酮等)的蛋白质沉降方法和有机溶剂(氯仿/甲醇、甲基叔丁基醚)萃取是生物样品前处理的常规技术，但对于组成及其复杂的生物样本，如血浆样本，高丰度蛋白去除不彻底，带来样本分析过程的污染问题和色谱分离柱的消耗问题，并且极难与高效毛细管液相色谱兼容分析血浆中代谢物；SPE和超滤膜成本较高，处理步骤繁琐、耗时较长。虽然在线SPE样品前处理简化了整个处理过程，手动操作步骤减少，但在线操作需要特殊设备，其维护和方法设置较复杂，且往往带来较长的色谱运行时间，因此，实验室和临床样本分析中很少用到。针对目前常用生物样本提取方法存在的需要分别提取极性和非极性代谢物组；且很难与毛细管高效液相色谱兼容性差等不足，本专利技术发展了一种从生物样本中同时提取极性和弱极性代谢物的新方法，单次提取同时获得生物样本中极性和弱极性的代谢物，继而通过毛细管液相色谱-质谱和高效液相色谱-质谱方法进行生物样本代谢物组分析。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种在生物样本中同时获得极性和弱极性代谢物并用于nanoLC-MS和LC-MS分析的新方法。该方法至少包括以下步骤：(1)向生物样品加入酸性蛋白变性剂，定量移取并加入内标溶液，涡旋混匀，得到体系I；(2)将步骤(1)中体系I进行极性和弱极性代谢物的选择性富集及杂质去除，得到体系II；(3)将步骤(2)中的体系II进行有机溶剂萃取，分别收集富含极性代谢物的上层和富含弱极性代谢物的下层。在优选的实施方式中，该方法还包括，将所述富含极性代谢物的上层进行毛细管液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析，将富含弱极性代谢物的下层进行超高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析。在该方法中，所述生物样品的体积为50μL～1200μL，酸性蛋白变性剂溶液用量为生物样品用量的0.1～1倍，优选地为0.1～0.4倍体积。优选地，酸性蛋白变性剂选自磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液、三氯乙酸水溶液中的至少一种。优选地，所述酸性蛋白变性剂溶液的浓度为0.1v％～5v％。在极性和弱极性代谢物选择性富集及杂质去除的步骤中，采用盐析辅助液液萃取。在优选的实施方式中，将盐析辅助液液萃取试剂加入到步骤(1)中所述体系I中，振荡，涡旋，离心，取上层上清液。所述盐析辅助液液萃取试剂包括亲水性有机溶剂和盐溶液，其中，优选所述亲水有机溶剂与生物样品的体积比为20:1～1:1，盐溶液和亲水性有机溶剂的体积比为1:1～1:4；进一步优选地，所述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙腈和异丙醇中的至少一种。进一步优选地，所述盐溶液选自磷酸氢二钾溶液、磷酸钾溶液和氯化镁溶液中的至少一种。优选地，所述盐溶液的溶剂为水，盐溶液的浓度为0.7M～4M。在将盐析辅助液液萃取试剂加入到体系I的步骤中，先加入所述盐溶液，再加入所述亲水有机溶剂。优选地，所述振荡的次数为10次。优选地，所述振荡之后进行涡旋，涡旋的时间为25～35秒。优选地，所述离心的条件为3000rpm～15000rpm离心20分钟-60分钟。优选地，亲水有机溶剂复溶的步骤包括：加入亲水有机溶剂后，超声，涡旋，取上清液。优选地，所述超声的时间为25秒～35秒，涡旋的时间为2秒～35秒。步骤(3)中所述极性和弱极性代谢物收集包括：将步骤(2)中所述体系II中的上清液干燥，加入液相色谱流动相A复溶，加入有机溶剂，振荡，涡旋，离心，上层上清液为极性代谢物富集组分，可用于nano-LC-MS分析极性代谢物和多肽组。下层溶液为弱极性代谢物富集组分，干燥后，加入液相色谱流动相B，振荡，涡旋，离心，上清液用于LC-MS分析弱极性代谢物和脂质组。优选地，所述液相色谱流动相A为体积分数为5％～30％的乙腈，溶剂为水，加入量为1/20～1/5倍生物样品体积。优选地，所述液相色谱流动相A与有机溶剂的体积比为1:1～5:1。优选地，所述超声的时间为25～35秒；所述涡旋的时间为25～35秒。优选地，所述离心的条件为3000rpm～15000rpm离心20～60分钟。优选地，所述液相色谱流动相B的体积分数为40％～60％乙腈，加入量为1/20～1/5倍生物样品体积。优选地，所述液相色谱流动相B与有机溶剂的体积比为1:1～5:1，进一步优选地，液相色谱流动相B的加入量为20μl～100μl。步骤(2)中去除的杂质包括高丰度蛋白、无机盐和固体杂质。生物样品包括血浆、血清、尿液、脑脊液、生物组织匀浆液。本申请所使用的萃取方法之一是盐析辅助液液萃取系统(SALLE)，它时一种萃取富集代谢物的有效手段，由亲水性有机溶剂、盐溶液组成，具有条件温和，操作简单，可调因素多等优势。本申请中，“高丰度蛋白质”，是指mg/ml级的蛋白质。本申请中，“nanoLC-MS”，是指纳升液相色谱-质谱分析。本申请中，所有涉及数值范围的条件均可独立地选自所述数值范围内的任意中间范围。本申请中，如无特别说明，所有涉及数值范围的条件均包含端点值。本申请中，本领域技术人员根据所述方案中涉及的范围条件(如体积比等)中的任一具体数值条件，均可完成本申请中的技术方案，实现本申请中所述的有效效果。通过本专利技术的方法，可以从血浆、血清、尿液、脑脊液、组织匀浆液等中，同时获得极性和弱极性代谢物，去除高丰度蛋白、无机盐和固体杂质等干扰物，用于nanoLC-MS非靶向分析极性代谢物组和多肽组，LC-MS分析非靶向和靶向分析弱极性代谢物，从而产生了如下有益效果。本申请能产生的有益效果包括：1.极性和弱极性代谢物来自于同一次提取，两者之间的相对重复性好于多次提取，便于多平台分析的数据整合。2.本申请中同时获取极性和弱极性代谢物，极性代谢物富集于上层，弱极性代谢物富集于下层，减少了生物样本用量。3.本申请中极性和弱极性代谢物首先富集于SALLE体系的上层亲水有机相，易于萃取液的转移，且亲水有机溶剂沸点低易于后处理。4.本申请中盐析辅助液液萃取所选用的亲水有机溶剂可与水完全混溶，因此不需要漫长或剧烈的混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：/n(1)向生物样品加入酸性蛋白变性剂，定量移取并加入内标溶液，涡旋混匀，得到体系I；/n(2)将步骤(1)中体系I进行极性和弱极性代谢物的选择性富集及杂质去除，得到体系II；/n(3)将步骤(2)中的体系II进行有机溶剂萃取，分别收集富含极性代谢物的上层和富含弱极性代谢物的下层。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
(1)向生物样品加入酸性蛋白变性剂，定量移取并加入内标溶液，涡旋混匀，得到体系I；
(2)将步骤(1)中体系I进行极性和弱极性代谢物的选择性富集及杂质去除，得到体系II；
(3)将步骤(2)中的体系II进行有机溶剂萃取，分别收集富含极性代谢物的上层和富含弱极性代谢物的下层。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述富含极性代谢物的上层进行毛细管液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析，将富含弱极性代谢物的下层进行超高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述生物样品的体积为50μL～1200μL，酸性蛋白变性剂溶液用量为生物样品用量的0.1～1倍，优选地为0.1～0.4倍体积；
优选地，所述酸性蛋白变性剂选自磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液、三氯乙酸水溶液中的至少一种。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述极性和弱极性代谢物选择性富集及杂质去除的步骤包括盐析辅助液液萃取；
优选地，所述极性和弱极性代谢物的选择性富集及杂质去除的步骤包括：将盐析辅助液液萃取试剂加入到步骤(1)中所述体系I中，振荡，涡旋，离心，取上层上清液；
优选地，所述盐析辅助液液萃取试剂包括亲水性有机溶剂和盐溶液，其中，优选所述亲水有机溶剂与生物样品的体积比为20:1～1:1，盐溶液和亲水性有机溶剂的体积比为1:1～1:4；
进一步优选地，所述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙腈和异丙醇中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓哲，刘丹，刘欣欣，程孟春，赵楠，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21