香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因和应用，属于林业昆虫分子生物学领域。该荧光定量内参基因为RPS13和RPL28基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。本发明专利技术通过香樟齿喙象的转录组测序数据库，选择了常用作内参基因的8个候选内参基因，通过5种算法评估候选内参基因的稳定性，获得了香樟齿喙象取食不同植物条件下的荧光定量内参基因，并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高。本申请为香樟齿喙象取食不同植物条件下的相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据。

Fluorescence quantitative internal reference gene and its application of Cinnamomum camphora tooth beak elephant feeding on different plants

【技术实现步骤摘要】
香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因和应用
本专利技术属于林业昆虫分子生物学领域，具体涉及香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因和应用。
技术介绍
香樟齿喙象(Pagiophloeustsushimanus)为鞘翅目Coleptera，象甲科Curculionidae，齿喙象属Pagiophloeus，为中国新纪录种，是一种专食香樟的钻蛀性害虫。成虫主要取食1-2年生的嫩枝表皮，幼虫取食木质部与韧皮部之间的形成层，受危害严重的香樟长势衰弱或枯死。目前，香樟齿喙象仅分布于中国上海市。该虫在上海市1年发生1代，以幼虫和成虫越冬。目前，上海市各个生态公益林中的香樟林均有大面积受该虫危害，且存在向外蔓延的趋势。由于香樟齿喙象是新纪录害虫，当前还未有关于香樟齿喙象功能基因的分子生物学研究。实时荧光定量Reversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction(RT-qPCR)是功能基因表达量的一种精确的定量方法，但它依赖于合适的内参基因对功能基因的相对表达定量进行数据标准化。内参基因必须在特定的实验条件下稳定表达。目前还没有香樟齿喙象内参基因鉴定与筛选的研究报道。利用实时荧光定量方法探究香樟齿喙象取食不同植物条件下功能基因的差异表达分析，就需要稳定可靠的内参基因。因此，有必要对该害虫取食不同植物条件下的内参基因稳定性进行筛选，否则无法对该害虫功能基因的相对表达定量进行研究。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因，能够满足实时荧光定量分析香樟齿喙象转录表达水平的要求，为香樟齿喙象取食不同植物条件下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据；本专利技术所要解决的另一技术问题是提供香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因的引物；本专利技术所要解决的再一技术问题是提供上述基因及其引物在香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量中的应用。为了解决上述问题，本专利技术采用的技术方案为：香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因，为RPS13和RPL28基因，其中，RPS13基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；RPL28基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。进一步的，RPS13基因的引物序列如下：RPS13正向引物：5’-ACGAAGTGTCCCTACATGGT-3’；RPS13反向引物：5’-TCAGGAGCAAGACCCATAGC-3’。进一步的，RPL28基因的引物序列如下：RPL28正向引物：5’-GCGGGTTGTCCCTTGTTAAA-3’；RPL28反向引物：5’-GGGCTCTGTAAAGGTGCTTG-3’。上述内参基因在香樟齿喙象取食不同植物荧光定量中的应用。所述的RPS13基因的引物序列在香樟齿喙象取食不同植物荧光定量中的应用。所述的RPL28基因的引物序列在香樟齿喙象取食不同植物荧光定量中的应用。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术通过香樟齿喙象的转录组测序数据库，参考选择了常用作内参基因的8个候选内参基因，鉴定了8个内参基因的基因序列，通过5种算法(geNorm、NormFinder、BestKeeper、DeltaCq和RefFinder)评估候选内参基因的稳定性，获得了适用于香樟齿喙象取食不同植物条件下稳定表达的内参基因RPS13和RPL28，并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，为香樟齿喙象取食不同植物条件下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据。附图说明图1是RT-qPCR引物扩增的特异性图；图中，第一排从左到右依次为RT-qPCR引物扩增内参基因RPL18、RPS27A、RPS13的特异性图；第二排从左到右依次为RT-qPCR引物扩增内参基因GAPDH、UBQ、RPL28的特异性图；第三排从左到右依次为RT-qPCR引物扩增内参基因RPS15和18SrRNA；第四排从左到右依次为目的基因PtsuOBP33和目的基因PtsuOBP37的特异性图；图2是香樟齿喙象取食不同植物的内参基因的平均Cq值图；图3是内参基因的RefFinder综合评价结果图；图4是geNorm算法中的成对变异值Vn/Vn+1图；图5是目的基因PtsuOBP33验证内参基因稳定性图；图6是目的基因PtsuOBP37验证内参基因稳定性图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术，但这些实施例并不用来限制本专利技术。以下实施例所采用的供试材料为：从上海市松江区泖冈镇香樟人工林(30°56′6.15″N，121°12′32.76″E)捕获香樟齿喙象成虫，采集新鲜的1-2年生香樟枝条按雌雄成虫1:1的比例于养虫盒(长×宽×高＝18cm×12cm×6cm)内混合饲养；每3d更换1次枝条，养虫室温度28±0.5℃，相对湿度70±5％。从枝头横断面处有明显产卵刻槽的部位收集雌成虫同一天产的卵。卵孵化的幼虫，采用人工饲料在温度28±0.5℃，相对湿度70±5％，光周期24L：0D条件下的恒温光照培养箱(RXZ型智能人工气候箱，宁波江南仪器厂)单头饲养，直至化蛹、羽化。分别用香樟、浙江桂与浙江楠的枝条配置成的半人工饲料饲养幼虫，同时分别用香樟、浙江桂与浙江楠的枝条饲养成虫。收集取食不同植物的幼虫与成虫，每种处理均有三个生物学重复，并分别用液氮冷冻处理，处理后迅速提取总RNA或在-80℃条件下保存。实施例11、香樟齿喙象取食不同植物的总RNA提取及cDNA的合成采用Trizol方法提取总RNA，并用5mL无RNase的DNaseI(TakaraBioInc.,Kusatsu,ShigaPrefecture,Japan)处理15分钟以去除DNA。使用ThermoScientificNanoDrop2000紫外可见分光光度计(ThermoFisherScientificInc.，Waltham，MA，USA)检测RNA的浓度和质量。利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。使用PrimeScriptTMII第一链cDNA合成试剂盒(TaKaRa，大连，中国)，按照说明书进行RNA的纯化和合成cDNA第一条链。在20.0μL反应体系中进行反转录，其中包含4.0μL5XPrimeScriptIVcDNASynthesisMix，1.0μL随机引物(50μM)，4.0μL总RNA，11.0μLRNase-freeddH2O；反转录程序为：30℃持续10分钟，42℃持续15分钟，70℃持续15分钟，最后降至4℃。cDNA产物保存在-20℃。2、内参基因的选择及其引物的设计根据文献查询其他昆虫中主要的内参基因并最终选择并设计了本实施例所需的8条候选内参基因，分别为RPL18(SEQIDNO.1)、RPS27A(SEQIDNO.2)、RPS13(SEQIDNO.3)、GAPDH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因，其特征在于，为RPS13和RPL28基因，其中，RPS13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；RPL28基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。/n

【技术特征摘要】
1.香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因，其特征在于，为RPS13和RPL28基因，其中，RPS13基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；RPL28基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。


2.权利要求1所述的香樟齿喙象取食不同植物的荧光定量内参基因的引物，其特征在于，RPS13基因的引物序列如下：
RPS13正向引物：5’-ACGAAGTGTCCCTACATGGT-3’；
RPS13反向引物：5’-TCAGGAGCAAGACCCATAGC-3’。


3.权利要求1所述的香樟齿喙象取食...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈聪，李寿银，郝德君，李慧，樊彬琦，王焱，张岳峰，韩阳阳，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32