一种山羊CADM2基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种山羊CADM2基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR技术，以山羊的基因组DNA为模板，利用一对特异性PCR引物扩增山羊CADM2基因的拷贝数变异区域部分片段，并应用另外一对特异性PCR引物扩增山羊内参基因MC1R部分片段作为对照，最后利用‑ΔΔCt判定个体的拷贝数变异类型。基于山羊CADM2基因拷贝数变异与生长性状之间的关联，本发明专利技术提供的方法可用于快速建立山羊遗传资源优势种群，有利于加快山羊分子标记辅助选择育种工作，该方法简单、快速，便于推广应用。

A CNV marker assisted detection method of goat cadm2 gene and its application

【技术实现步骤摘要】
一种山羊CADM2基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其应用
本专利技术属于分子遗传育种领域，具体涉及一种检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组DNA进行实时定量PCR，以MC1R基因为参照，根据2-ΔΔCt值确定个体的拷贝数类型。
技术介绍
基因组DNA携带生物体的所有遗传信息，研究证明，遗传信息的改变是相关重要经济性状变异的主要来源，随着分子育种学技术、分子生物学及高通量测序技术的日渐成熟，人们在筛选及鉴定经济性状相关基因方面认识愈加深刻，然而，如何精确而有效的利用分子育种学技术发掘这些重要表型相关位点是一项值得突破的重要任务。目前分子育种上，主要的研究方向集中在标记辅助选择(molecularmark-assistselection,MAS)上，该技术是通过DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。拷贝数变异(CopyNumberVariations，CNVs)指大小从1kb到数Mb的DNA片段拷贝数突变。CNVs是由基因重排导致的，它是基因组变异的重要组成部分，可导致由基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等引起的表型多态性。研究表明，拷贝数变异可能影响基因网络并调节相关基因的表达，促成个体表型，因此，检测与山羊体尺相关基因的CNVs标记有助于加速山羊遗传选育的进展。在检测已知CNV的各种方法中，实时定量PCR(quantitiveReal-TimePCR,qPCR)是使用比较广泛的一种技术。该方法操作简单、敏感性高、速度快，通过对目的基因(有拷贝数变异)和内参基因(无拷贝数变异)进行相对定量，然后利用-ΔΔCt判定个体的拷贝数变异类型。CADM2(CellAdhesionMolecule2)属于免疫蛋白超家族的细胞粘附分子(CADMs)的一类，具有1个或多个IgV样或C样结构域。近年来国内外对CADM2基因的研究较少，CADM2的功能及作用机制的认识都还处在初步阶段。关于CADM2基因的功能研究表明，其在人和小鼠的神经分化等方面具有重要调控作用。目前为止，尚未见到关于利用山羊CADM2基因拷贝数变异辅助检测山羊生长性状的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种山羊CADM2基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其应用，从而加速山羊良种选育。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以山羊个体基因组DNA为模板，以引物对P1和引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增CADM2基因的拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定山羊个体CADM2基因的拷贝数变异类型。优选的，所述的CADM2基因的拷贝数变异区域位于山羊CADM2基因候选区域Chr1:31812401-31814400(参考序列为NC_030808.1)。优选的，所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，-ΔΔCt>0.5；缺失型，-ΔΔCt<-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。优选的，所述的引物对P1为：上游引物F1：5’-CCCAGATCATTGCAGGGAAAGTA-3’下游引物R1：5’-ACTCTTTTCAACAGTGGAGCTAT-3’；所述的引物对P2为：上游引物F2：5’-GGGCAGTCCCTTGACAAAGA-3’下游引物R2：5’-ATCTCCCCAGCCTCCTCATT-3’。优选的，所述的实时定量PCR所用的扩增体系包括：10～50ng/μL模板DNA1μL、10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL以及PremixExTaqTMII5μL和ddH2O3μL。优选的，所述的实时定量PCR所用的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共39个循环。优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为152bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为129bp。上述检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。优选的，所述山羊(例如，贵州黑山羊、贵州白山羊、河南杂交山羊、贵州努比亚山羊)中，具有缺失型拷贝数变异类型的个体在体高、体长、胸围、体重、管围等生长性状上优于具有多拷贝型、正常型的个体。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术以内参基因MC1R作为对照，采用实时定量PCR对山羊CADM2基因(CADM2基因的拷贝数变异区域)的CNV类型进行了检测，发现该CADM2基因的拷贝数变异可以作为分子标记，与现有方法相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术提供的山羊CADM2基因拷贝数变异检测方法，不受年龄和性别的限制，可用于山羊早期选育；2.与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，本专利技术快速、简单、成本低，能够准确的鉴定山羊个体的拷贝数类型；3.本专利技术在一定程度上为山羊生长性状的分子标记辅助选择提供科学依据，可快速建立山羊遗传资源优势种群，从而加快育种过程。附图说明图1为本专利技术中进行qPCR(CADM2基因)绘制的扩增曲线。图2是本专利技术中进行qPCR(CADM2基因)绘制的溶解曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例对专利技术做详细说明，所述实施例是对本专利技术的解释，而不是对本专利技术保护范围的限制。本专利技术利用实时定量PCR对山羊CADM2基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：(1)利用NCBI数据库的山羊CADM2基因序列，再用Primer-BLAST网站进行引物设计，并用普通PCR检验引物；(2)采用实时荧光定量PCR技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；(3)利用SPSS23.0软件将拷贝数变异类型与山羊生长性状进行关联分析，筛选到与山羊生长性状相关的CNV标记；(4)根据拷贝数变异类型挑选获得生长性状优异的山羊种群，进行选育。1.山羊样本采集本专利技术以贵州白山羊、贵州黑山羊、贵州努比亚山羊和河南杂交山羊为检测对象，采集和使用了443头山羊个体的血液样本(见表1)。并记录它们的生长性状数据，如体高、体重、体长、胸围、体斜长及管围等，以用于后续的关联分析。表1.样品信息2.血样基因组DNA的提取(1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液；重复本步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n以山羊基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增CADM2基因的拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果确定山羊CADM2基因的拷贝数变异类型。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：
以山羊基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增CADM2基因的拷贝数变异区域及作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果确定山羊CADM2基因的拷贝数变异类型。


2.如权利要求1所述一种检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的CADM2基因的拷贝数变异区域位于山羊CADM2基因候选区域Chr1:31812401-31814400。


3.如权利要求1所述一种检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，-ΔΔCt>0.5；缺失型，-ΔΔCt<-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。


4.如权利要求1所述一种检测山羊CADM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的引物对P1为：
上游引物F1：5’-CCCAGATCATTGCAGGGAAAGTA-3’
下游引物R1：5’-ACTCTTTTCAACAGTGGAGCTAT-3’；
所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄永震，徐子洁，蔡雯雯，刘贤，文逸凡，安清明，张子敬，王大会，贺花，王献伟，徐泽君，陈宏，胡沈荣，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61