一类新型BODIPY动态荧光探针的制备方法及活细胞实时检测谷胱甘肽浓度变化的应用技术

本发明专利技术涉及一类新型BODIPY动态荧光探针的制备方法及其活细胞实时检测谷胱甘肽浓度变化的应用，该类动态荧光探针首次被合成，以中间体式(Ⅰ)所示通式的化合物为母核，分别与3，4，5‑三甲氧基苯甲醛和4‑甲基‑1‑(2‑氰基‑乙酰基)‑哌嗪进行区域选择性Knoevenagel缩合反应，得式(Ⅱ)所示通式的BODIPY动态荧光探针。本发明专利技术创造性地在中间体式(Ⅰ)和动态荧光探针式(Ⅱ)引入不同的推/拉电子取代基，并首次合成了以BODIPY为母核的中间体及动态荧光探针。本发明专利技术提供的一类新型BODIPY动态荧光探针，解决了现有的BODIPY荧光探针无法实时动态检测谷胱甘肽或

Preparation of a new type of BODIPY dynamic fluorescent probe and its application in real-time detection of glutathione concentration in living cells

【技术实现步骤摘要】
一类新型BODIPY动态荧光探针的制备方法及活细胞实时检测谷胱甘肽浓度变化的应用
本专利技术涉及荧光探针活细胞成像
，具体涉及一类新型BODIPY动态荧光探针的合理设计、制备方法及其活细胞实时检测谷胱甘肽浓度变化的应用。
技术介绍
谷胱甘肽(GSH)，哺乳动物细胞中存在的最丰富的非蛋白硫醇(0.5-10mM)，其以还原型巯基形式(GSH)和氧化型二硫化物形式(GSSG)的比例变化，在调节细胞代谢、细胞信号转导和维护氧化还原内稳态等方面发挥着非常重要的生理学和病理学作用。GSH稳态的紊乱与多种人类疾病有关，如阿尔茨海默病和帕金森氏病、艾滋病、肝肺损伤和心血管疾病等。此外，GSH水平升高会降低放疗和化疗对癌细胞的疗效。由于其重要性，开发实时成像和定量检测活细胞中谷胱甘肽的精密荧光探针，以给出更精确的时空和生物化学分辨率，对阐明细胞GSH生物化学动力学和与其相关的人类疾病的诊断治疗具有重要意义。在过去的几十年里，光学探针已经被广泛应用于检测活细胞中的GSH。近年来，考虑到可逆共价化学中的共价键具有动态可逆的特点，研究人员基于可逆迈克尔/亲核加成反应，开发出了新一代动态可逆型检测GSH的荧光探针。然而，目前报道的GSH可逆探针仍有诸多缺点，例如反应动力学慢、荧光量子产率低、激发波长短、化学稳定性差以及探针本身固有的线粒体靶向性等。考虑到适合实时成像和定量细胞内GSH浓度变化的动态荧光探针仍然非常有限，以及BODIPY染料易于官能团化修饰和优秀的光物理性质，因此BODIPY荧光团被认为是用于活细胞内实时成像与定量GSH浓度变化的理想荧光探针。
技术实现思路
本专利技术提供了一类新型BODIPY动态荧光探针，解决了现有的BODIPY荧光探针无法动态可逆性检测谷胱甘肽或meso-位点过度激活、化学稳定性差、对谷胱甘肽检测的选择性差以及无法选择性激活α-位点等一系列技术问题，并将其首次应用于活细胞实时检测谷胱甘肽浓度变化。本专利技术提供了一类新型BODIPY动态荧光探针，具有如式(I)、式(II)所示的结构式，见图1：本专利技术以式(I)中的结构式为母核，创造性地进行BODIPY母核改造，通过两步区域选择性的Knoevenagel缩合反应在BODIPY母核的两个α-位点(3,5-位)分别引入具有不同推/拉电子能力的取代基，即3，4，5-三甲氧基苯基与4-甲基-1-(2-氰基乙酰基)-哌嗪季铵盐，得到其衍生物，中间体见附图1，合成路线见附图2。作为优选，本专利技术两步区域选择性Knoevenagel缩合反应的溶剂为甲苯，温度为35°C和85°C，缩合反应中的哌啶和乙酸的体积比为1：1。作为优选，本专利技术引入3，4，5-三甲氧基苯基，延长共轭体系，将BODIPY动态探针的紫外吸收和荧光发射波长向近红外区红移，并提高了探针meso-位点的内在化学稳定性。作为优选，本专利技术引入4-甲基-1-(2-氰基乙酰基)-哌嗪，实现了BODIPY母核α-位点的选择性激活，赋予了BODIPY动态探针对谷胱甘肽的快速可逆性以及选择性实时检测的能力。作为优选，本专利技术引入甲基哌嗪季铵盐，一方面可提高BODIPY动态探针的水溶性与细胞膜可穿透性，另一方面阳离子季铵盐与带负电荷的生物硫醇可通过静电相互作用加速可逆迈克尔加成反应的进行，提高了BODIPY动态探针与谷胱甘肽的反应动力学速率。作为优选，本专利技术选择BODIPY作为母核，一方面其作为拉电子基团，进一步激活了α-位点与谷胱甘肽的反应活性；另一方面由α-位点的C=C双键与BODIPY母核的非共平面效应产生的扭转张力进一步提高了可逆迈克尔加成反应速率。此外，本专利技术提供了一种实时动态监测谷胱甘肽浓度变化的溶液测试方法，如下：1)在37°C条件下，将BODIPY(500μM)动态荧光探针溶于DMF溶液中，加入到含有不同浓度谷胱甘肽(0-12mM)的PBS(pH=7.4)溶液中，混合均匀后得到含有BODIPY(5μM)动态荧光探针的检测体系；2)待体系稳定一分钟后，使用紫外分光光度计记录300-800nm的吸收光谱，使用荧光分光光度计记录580-800nm的发射光谱，其激发波长为575nm，使用狭缝宽度为2.5/2.5nm；3)将不可逆硫醇捕获剂N-乙基马来酰亚胺(NEM200mM)溶于PBS(pH=7.4)溶液中，等当量地加入到2)的体系中以不可逆地消耗谷胱甘肽，待体系稳定一分钟后，继续使用紫外分光光度计记录300-800nm的吸收光谱，使用荧光分光光度计记录580-800nm的发射光谱，其激发波长为575nm，使用狭缝宽度为2.5/2.5nm。本专利技术提供了一种活细胞实时动态检测谷胱甘肽浓度变化的方法，如下：A549细胞在37°C玻璃底培养皿中培养。70%细胞覆盖后，移除培养基，并用PBS洗涤2次。然后加入BODIPY动态荧光探针(5µM溶于PBS，含有0.1%PluronicF-127和DMSO)。在37°C条件下孵育15分钟后，用PBS洗涤细胞三次，最后加入PBS代替培养基。使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)对其进行时间序列荧光成像，成像过程中通过序列加入N-乙基马来酰亚胺(NEM2mM)和细胞膜可穿透的谷胱甘肽单乙酯(GSH-OEt,5mM)来调节A549细胞中的谷胱甘肽浓度随时间的变化。其所用激发波长为594nm，红色荧光通道收集范围为600-620nm，每10.28秒收集一张荧光图像，总共收集23分钟。附图说明图1所述新型BODIPY动态荧光探针与中间体的结构式。图2所述新型BODIPY动态荧光探针与中间体的合成路线。图3所述新型BODIPY动态荧光探针在GSH(5mM)/NEM(5mM)反应序列下的紫外吸收光谱变化与时间依赖的吸收光谱反应动力学曲线。图4所述新型BODIPY动态荧光探针在GSH(5mM)/NEM(5mM)反应序列下的荧光发射光谱变化与时间依赖的发射光谱反应动力学曲线。图5所述新型BODIPY动态荧光探针在不同GSH浓度下(0-12mM)的紫外吸收光谱与GSH浓度依赖的吸收光谱滴定曲线。图6所述新型BODIPY动态荧光探针在不同GSH浓度下(0-12mM)的荧光发射光谱与GSH浓度依赖的发射光谱滴定曲线。图7所述新型BODIPY动态荧光探针对GSH检测的化学选择性。图8所述新型BODIPY动态荧光探针在不同pH条件下的化学稳定性。图9所述新型BODIPY动态荧光探针对A549细胞的生物兼容性。图10所述新型BODIPY动态荧光探针在A549细胞中实时成像GSH动力学的时间依赖的平均荧光强度变化曲线。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做出进一步的解释和说明，基于本专利技术中的实施例，本领域的技术人员，在没有做出创造性的劳动成果下所获得的其他实施例，都属于本专利技术的保护范围。实施例一：α-TMB-CHO合成，合成路线见附图2。3，4，5-三甲氧基苯甲醛(981mg,5mmol)溶于干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一类用于活细胞实时检测谷胱甘肽浓度变化的新型BODIPY动态荧光探针及中间体，其特征在于，具有如式 (Ⅰ) (Ⅱ) 所示结构，见附图1。/n

【技术特征摘要】
1.一类用于活细胞实时检测谷胱甘肽浓度变化的新型BODIPY动态荧光探针及中间体，其特征在于，具有如式(Ⅰ)(Ⅱ)所示结构，见附图1。


2.根据权利要求1所述的新型BODIPY动态荧光探针，其特征在于，创造性地进行BODIPY母核改造，通过两步区域选择性的Knoevenagel缩合反应在BODIPY母核的两个α-位点(3,5-位)分别引入具有不同推/拉电子能力的取代基，即3，4，5-三甲氧基苯基与4-甲基-1-(2-氰基乙酰基)-哌嗪季铵盐，得到其衍生物，合成路线如下见附图2。


3.根据权利要求2所述新型BODIPY动态荧光探针的制备方法，其特征在于，两步区域选择性Knoevenagel缩合反应的溶剂为甲苯，温度为35°C和85°C，缩合反应中的哌啶和乙酸的体积比为1：1。


4.根据权利要求1所述新型BODIPY动态荧光探针，其特征在于，引入3，4，5-三甲氧基苯基，延长共轭体系，将BODIPY动态荧光探针的紫外吸收和荧光发射波长向近红外区红移，并提高了探针meso-位点的内在化学稳定性。


5.根据权利要求1所述新型BODIPY动态荧光探针，其特征在于，引入4-甲基-1-(2-氰基乙酰基)-哌嗪，实现了BODIPY母核α-位点的选择性激活，赋予了BODIPY动态探针对谷胱甘肽的快速可逆性以及选择性实时检测的能力。


6.根据权利要求1所述新型BODIPY动态荧光探针，其特征在于，引入甲基哌嗪季铵盐，一方面可提高BODIPY动态探针的水溶性与细胞膜可穿透性，另一方面阳离子季铵盐与带负电荷的生物硫醇可通过静电相互作用加速...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昌华，张玉石，翟文豪，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12