一种基于生物膜力学探针系统的超准力钳实验方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于生物膜力学探针系统的超准力钳实验方法。力钳实验涉及有探针端和目标端，探针端包括有探针小球、红细胞，其特征在于：在生物膜力学探针力钳实验中，在探针端增加了参考小球，参考小球通过蛋白质分子间的强相互作用粘贴在吸取红细胞的第一微吸管端部，并实时追踪参考小球位于靠近红细胞一侧边界和探针小球位于靠近红细胞一侧边界之间的相对距离，通过反馈算法控制目标端的移动而进行力钳实验。本发明专利技术通过增加参考小球并开发基于生物膜力学探针系统的“双边界”力追踪模式，显著提升了作用在分子键上的力的准确性，能够对解离速率较慢的分子键施加准确、稳定的作用力，显著延长了分子键结合时间的记录时限，进行长时间记录。

An experimental method of super precision forceps based on the probe system of biomembrane mechanics

【技术实现步骤摘要】
一种基于生物膜力学探针系统的超准力钳实验方法
本专利技术涉及检测生物大分子间相互作用解离速率的定量检测方法，尤其是涉及一种基于生物膜力学探针系统的超准力钳实验方法。
技术介绍
随着单分子力谱技术的发展，原子力显微镜、光镊、磁镊、生物膜力学探针等技术已经在单分子水平解析了多种生物力对单分子键的调控规律。生物膜力学探针(BFP)系统兼具弹性系数小、操作难度低、易于对活细胞操作等优势，尤其适用于对活细胞表面生物大分子相互作用的原位检测。作为动态力谱实验的重要组成部分，“力钳”实验将作用在分子键上的作用力快速加载到设定值，观测并收集单分子键在该设定力值作用下的结合时间，从而可以不经过模型拟合直接得到分子键的受力调控规律，并可以根据“贝尔”模型拟合得出“0”力条件下分子键的解离速率(dissociationrate，koff)。因此，基于生物膜力学探针系统的“力钳”实验尤其适用于膜蛋白相关分子键解离速率的原位检测。尽管生物力学力钳实验已经检测了多种解离速率较快的瞬态分子间相互作用，但是它仍然无法应用于解离速率较慢的分子间相互作用的研究。这是因为在检测过程中缺少力的反馈控制功能，在分子键的较长结合时间内各种扰动都会导致作用在分子键上的力值不断偏移；此外，在超长分子键结合时间的记录过程中，探针端也会产生整体漂移，即便探针端小球的位置被维持在设定位置，实际作用在分子键上的力也可能产生较大偏差，最终造成测量结果准确性较差，甚至得出错误结论。因此，提升作用在分子键上力的稳定性、准确性是应用基于生物膜力学探针系统的“力钳”技术准确检测较强分子间相互作用解离速率的首要条件。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术目的在于提供一种基于生物膜力学探针系统的超准力钳实验方法。本专利技术通过在“力钳”实验中额外添加一个参考小球校正探针端的整体漂移，提升记录力值的准确性，并在“力钳”实验控制中的“记录分子键结合时间”阶段嵌入了PID反馈控制算法，将“记录分子键结合时间”阶段内记录的力值稳定“钳制”在设定位置，最终实现对作用在分子键上的力稳定而准确的钳制。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是：在生物膜力学探针力钳实验中，有探针端和目标端，探针端包括有探针小球、红细胞，在探针端增加了参考小球，参考小球通过蛋白质分子间的相互作用粘贴在吸取红细胞的第一微吸管端部，并实时追踪参考小球位于靠近红细胞一侧边界和探针小球位于靠近红细胞一侧边界之间的相对距离来控制目标端的移动而进行力钳实验。方法具体为：1)初始化阶段：压电运动平台控制目标端远离探针端处于初始位置并静止，此时红细胞处于初始状态，以参考小球位于靠近红细胞一侧边界和探针小球位于靠近红细胞一侧边界的两个边界之间的距离作为相对距离，通过高速相加拍摄实时追踪相对距离，以0.2秒内记录的相对距离的平均值作为初始相对距离，随后进入下一阶段；2)撞击阶段：实时监测相对距离，压电运动平台经第二微吸管带动目标端的细胞/小球按照预先设定速度向靠近红细胞运动，对心推动探针小球压缩红细胞，直至相对距离减小了预先设定的压缩距离，进入下一阶段；3)接触阶段：实时监测相对距离，压电运动平台保持静止，探针小球与细胞/小球稳定接触，经过预先设定接触时间后，进入下一阶段；4)撤回阶段：压电运动平台经第二微吸管带动目标端的细胞/小球按照预先设定速度向远离红细胞撤回运动；在撤回过程中，实施监测相对距离，若该相对距离比初始相对距离增加了预先设定力值对应的长度，力值为分子键间的作用力的值，即红细胞被拉伸设定长度，则本次实验为粘附事件，压电运动平台立即停止当前撤回运动，进入结合时间记录阶段；若该相对距离恢复到初始相对距离而未被拉伸，则直接进入6)重置阶段；5)结合时间记录阶段：实时监测相对距离，与此同时，压电运动平台根据预先设定力值对应的相对距离与实际相对距离的偏差实施反馈补偿，直至相对距离再次恢复到初始相对距离，即分子键自动断裂，进入重置阶段；预先设定力值对应的相对距离即为初始相对距离加上预先设定力值对应的长度，但由于环境扰动导致第一微吸管的末端会偏离偏移，使得实际相对距离偏离预先设定力值对应的相对距离，因此通过实时反馈补偿将相对距离稳定在设定力值对应的相对距离。6)重置阶段：实时监测相对距离，压电运动平台已撤回至初始位置，结束当前循环，保存当前次实验的相对距离、时间等数据并准备下一次循环。生物膜力学探针系统中，红细胞的作用是力传感器，在一定力的范围内类似于一种线性弹簧，相对距离的变化可以根据红细胞的弹性系数换算为实时作用在分子键上的力值。本专利技术在“力钳”实验中增加了参考小球，利用蛋白质分子间的相互作用粘贴在吸取红细胞的微吸管尖端，以“双边界”追踪模式对作用在分子键上的力进行准确追踪，并增加了力的反馈控制功能，可以对作用在分子键上的力实施稳定、准确的钳制。所述步骤5)中，将实时监测的相对距离作为实际相对距离，将实际相对距离经PID控制器的滤波器滤波处理后，和预先设定的力值对应的参考相对距离作相减获得偏差，将该偏差输入到PID控制器，PID控制器输出的偏差控制量输入到控制压电运动平台的运动模块，执行反馈补偿运动。所述的第一微吸管表面吸附有Spy-tag蛋白质分子，参考小球表面包被了Spy-catcher蛋白质分子，通过Spy-tag、Spy-catcher蛋白质分子间的相互作用将参考小球固定粘附于第一微吸管端部侧面。所述的参考小球的直径大于探针小球的直径，可以在实验过程中通过小球的尺寸直观地进行区分。所述的参考小球为玻璃球。所述的力钳实验中，开始以初始的数据采样时间间隔的3倍作为数据记录时间间隔对力值数据进行采样并记录于寄存器中，当分子键结合时间超过5秒后，数据记录时间间隔增加为采样时间间隔的20倍；当记录数据次数超过5000次后，数据记录时间间隔进一步增大5倍。本专利技术具有的有益效果是：本专利技术通过增加参考小球并开发基于生物膜力学探针系统的“双边界”力追踪模式，显著提升了作用在分子键上的力的准确性；在“力钳”实验控制“记录分子键结合时间”阶段中嵌入力的反馈控制，实现了对“力钳”实验中分子键结合时间内作用在分子键上力的稳定“钳制”；并能够动态调整记录时间间隔，显著延长了分子键结合时间的记录时限。本专利技术主要针对生命科学领域中较强分子间相互作用解离速率受力调控实验，能够更加准确、有效地获得单分子键在生物力作用下结合时间的变化情况。相比于原“力钳”实验，本专利技术所涉及的“力钳”实验具有以下优势：1)结合时间内作用在分子键上的力更加准确、稳定地被“钳制”在设定力值；2)分子键结合时间的记录时限延长至200秒以上。因此，本专利技术能够对解离速率较慢的分子键施加准确、稳定的作用力，并对分子键的结合时间进行长时间记录，尤其适用于较强分子间相互作用解离速率受力调控规律的原位检测。附图说明图1是本专利技术所涉及的基于生物膜力学探针系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于生物膜力学探针系统的超准力钳实验方法，力钳实验涉及有探针端和目标端，探针端包括有探针小球(3)、红细胞(2)，其特征在于：在生物膜力学探针力钳实验中，在探针端增加了参考小球(7)，参考小球(7)通过蛋白质分子间的相互作用粘贴在吸取红细胞(2)的第一微吸管(1)端部，并实时追踪参考小球(7)位于靠近红细胞(2)一侧边界和探针小球(3)位于靠近红细胞(2)一侧边界之间的相对距离来控制目标端的移动而进行力钳实验。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于生物膜力学探针系统的超准力钳实验方法，力钳实验涉及有探针端和目标端，探针端包括有探针小球(3)、红细胞(2)，其特征在于：在生物膜力学探针力钳实验中，在探针端增加了参考小球(7)，参考小球(7)通过蛋白质分子间的相互作用粘贴在吸取红细胞(2)的第一微吸管(1)端部，并实时追踪参考小球(7)位于靠近红细胞(2)一侧边界和探针小球(3)位于靠近红细胞(2)一侧边界之间的相对距离来控制目标端的移动而进行力钳实验。


2.根据权利要求1所述的一种基于生物膜力学探针系统的超准力钳实验方法，其特征在于：方法具体为：
1)初始化阶段：
压电运动平台(6)控制目标端(4、5)远离探针端(1、2、3、7)处于初始位置并静止，此时红细胞(2)处于初始状态，以参考小球(7)位于靠近红细胞(2)一侧边界(9)和探针小球(3)位于靠近红细胞(2)一侧边界(8)的两个边界之间的距离作为相对距离(10)，通过高速相加拍摄实时追踪相对距离，以0.2秒内记录的相对距离的平均值作为初始相对距离，随后进入下一阶段；
2)撞击阶段：实时监测相对距离，压电运动平台(6)经第二微吸管(5)带动目标端的细胞/小球(4)按照预先设定速度向靠近红细胞(2)运动，对心推动探针小球(3)压缩红细胞(2)，直至相对距离减小了预先设定的压缩距离，进入下一阶段；
3)接触阶段：实时监测相对距离，压电运动平台(6)保持静止，探针小球(3)与细胞/小球(4)稳定接触，经过预先设定接触时间后，进入下一阶段；
4)撤回阶段：压电运动平台(6)经第二微吸管(5)带动目标端的细胞/小球(4)按照预先设定速度向远离红细胞(2)撤回运动；
在撤回过程中，实施监测相对距离，若该相对距离比初始相对距离增加了预先设定力值对应的长度，则本次实验为粘附事件，压电运动平台(6)立即停止当前撤回运动，进入结合时间记录阶段；
若该相对距离恢复到初始相对距离而未被拉伸，则直接进入6)重置阶段；
5)结合时间记录...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，安宸毅，胡炜，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33