一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法技术

本发明专利技术属植物性毒物毒性评价技术领域，针对现有研究不能阐释枣花花蜜对蜜蜂的毒性作用的现状，提供一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法；收集枣花病蜜蜂并以健康蜜蜂作为对照，采集这两组蜜蜂的血淋巴，采用UPLC‑Q‑TOF MS技术结合多维统计分析对样本进行全谱分析，获得一级质谱和二级质谱数据，采用XCMS软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，从代谢物中筛选与蜜蜂枣花病有关的代谢物靶标和代谢轮廓，以代谢物靶标分析和代谢轮廓分析为指导，开展枣花花蜜对蜜蜂致病性的追踪、筛选，阐述枣花花蜜对蜜蜂的毒性作用机制。本发明专利技术具有成本低，易于操作，检测快速，灵敏度高，选择性强，重复性好，获得信息全面等优点。

A study method of toxic effect of jujube nectar on honeybee based on metabonomics

【技术实现步骤摘要】
一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法
本专利技术属于植物性毒物毒性评价
，具体涉及一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法；基于分子生物学的评估方法，通过研究枣花花蜜对意大利蜜蜂代谢路径的影响，评估枣花花蜜对蜜蜂毒性效应。
技术介绍
枣花病又称枣花中毒，常发生于枣花流蜜期，蜜蜂采集枣花蜜后造成大量采集蜂死亡，蜂群的群势下降。枣花病不仅影响枣花期蜂蜜和王浆的产量，还会影响蜜蜂对枣树的授粉。关于枣花病的病因，一般认为气候干旱、蜜汁浓稠、枣花花蜜中较高的钾离子浓度等有关。然而这些研究大多建立在推测及以成熟枣花蜜来研究蜜蜂枣花病的成因。但是蜜蜂采集的花蜜需经过一系列复杂过程才成为成熟蜂蜜，其中包括花蜜成分的改变。因此成熟枣花蜜对蜜蜂的作用并不能解释枣花花蜜对蜜蜂的毒性效应。鉴于此，探索和建立一种快速、敏感性高的分析技术尤为重要，这有助于阐明蜜蜂枣花病的发生原因，为蜜蜂枣花病的防治提供理论依据。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学方法，主要研究在新陈代谢的动态过程中，系统研究代谢产物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法，其特征在于：收集枣花病蜜蜂并以健康蜜蜂作为对照，采集这两组蜜蜂的血淋巴，采用UPLC-Q-TOF MS技术结合多维统计分析对样本进行全谱分析，获得一级质谱和二级质谱数据，随后采用XCMS软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，使用SIMCA软件对质谱数据进行多维统计分析；从代谢物中筛选与蜜蜂枣花病有关的血淋巴异常代谢物靶标和代谢轮廓，获得代谢指纹图谱；在枣花病组中显著上调的，VIP值>5的代谢产物17种，下调的代谢产物18种；以血淋巴代谢物靶标分析和代谢轮廓分析为指导，开展枣花花蜜对蜜蜂致病性的追踪、筛选，阐述枣花花蜜对蜜蜂毒性的作用机制...

【技术特征摘要】
1.一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法，其特征在于：收集枣花病蜜蜂并以健康蜜蜂作为对照，采集这两组蜜蜂的血淋巴，采用UPLC-Q-TOFMS技术结合多维统计分析对样本进行全谱分析，获得一级质谱和二级质谱数据，随后采用XCMS软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，使用SIMCA软件对质谱数据进行多维统计分析；从代谢物中筛选与蜜蜂枣花病有关的血淋巴异常代谢物靶标和代谢轮廓，获得代谢指纹图谱；在枣花病组中显著上调的，VIP值>5的代谢产物17种，下调的代谢产物18种；以血淋巴代谢物靶标分析和代谢轮廓分析为指导，开展枣花花蜜对蜜蜂致病性的追踪、筛选，阐述枣花花蜜对蜜蜂毒性的作用机制；显著差异的代谢产物主要富集到5个代谢通路，这5个相关代谢通路参与了蜜蜂对枣花花蜜的代谢过程。


2.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）采样提取代谢物：采集患枣花病的蜜蜂，并以同期健康蜜蜂作为对照，带回实验室后采集血淋巴并提取代谢物；
（2）分离代谢物：对提取的代谢物采用Agilent1290InfinityLC超高效液相色谱系统UHPLC，HILIC色谱柱进行分离；
（3）分析样品：样品经UHPLC分离后用Triple-TOF5600质谱仪ABSCIEX进行质谱分析；
（4）分析质谱数据：用XCMS软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，并使用SIMCA软件对质谱数据进行多维统计分析。


3.根据权利要求2所述的一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法，其特征在于：步骤（1）中采样的具体方法为：在枣花流蜜期收集已取食枣花花蜜并在蜂巢前爬行的出现枣花病症状的蜜蜂，并同时采集未取食枣花花蜜的健康蜜蜂作为对照，用纱笼迅速带回实验室；取蜜蜂血淋巴，每组取六个样；
代谢物的提取方法为：每个样本取30uL血淋巴，加入1mL预冷v/v/v为甲醇/乙腈/水=2:2:1，混匀，冰浴中超声60min，-20℃孵育1h后沉淀蛋白，16000g、4℃离心20min后，取上清液真空干燥；质谱检测时加入100μL的v/v为1:1的乙腈-水溶液复溶，14000g、4℃离心15min，取上清进样分析。


4.根据权利要求2所述的一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法，其特征在于：步骤（2）中具体方法为：对收集的各样本进行方法学考察，建立超高液相色谱-串联质谱技术检测蜜蜂血淋巴代谢物的指纹图谱；
其中：超高效液相色谱分析条件为：整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中，样品采用Agilent1290InfinityLC超高效液相色谱系统，UHPLC，HILIC色谱柱进行分离；进样量为5μL，柱温25℃，流速0.3mL/min；色谱流动相A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；色谱梯度洗脱程序如下：0-0.5min，95%B；0.5-7min，B从95%线性变化至65%；7-9min，B从65%线性变化至40%；9-10min，B维持在40%；10-11.1min，B从40%线性变化至95%；11.1-16min，B维持在95%；样本队列中插入QC样品，监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性；
质谱条件为：每例样品分别采用电喷雾电离进行正离子和负离子模式检测；样品经UPLC分离后用Triple-TOF560...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑先云，马卫华，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14