一种原位检测CHRNA5基因SNP rs16969968的方法技术

本发明专利技术公开了一种原位检测CHRNA5基因SNP rs16969968的方法。本发明专利技术提供了用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的成套原位杂交探针，由cRNA原位杂交探针1和cRNA原位杂交探针2组成；所述cRNA原位杂交探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述cRNA原位杂交探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术实现了在原位检测CHRNA5基因的rs16969968位点不同基因型及突变状态的原位检测，以保留细胞位置、类型等关键细胞信息，为针对性干预CHRNA5表达提供依据。

A method for in situ detection of chrna5 gene SNP rs16969968

【技术实现步骤摘要】
一种原位检测CHRNA5基因SNPrs16969968的方法
本专利技术涉及生物技术及医学检测领域，具体涉及一种原位检测CHRNA5基因SNPrs16969968的方法。
技术介绍
尼古丁乙酰胆碱受体(Nicotinicacetylcholinereceptors，nAChRs)是一种配体门控离子通道蛋白，在神经系统和许多非神经元组织细胞中均表达，如皮肤、胰腺、正常人支气管上皮细胞和肺癌细胞等，研究表明nAChRs除了在突触传递中的作用外，还可能参与其他生物学过程。近年来，全基因组关联研究(genome-wideassociationstudies，GWAS)表明，染色体15q24-15q25.1上nAChRs簇的等位基因变异rs16969968与肺癌的发病风险有关。许多研究证实，含有CHRNA5/A3/B4的15q25.1染色体上的nAChR基因簇的突变与吸烟及肺癌密切相关，编码α5-nAChR的CHRNA5基因与肺癌的发生尤为有关。SunH等研究表明抑制α5-nAChR的表达能够抑制A549细胞的迁移和侵袭，促进E-cadherin的表达。另外，α5-nAChR也被证实在胃癌中发挥作用，α5-nAChR在胃癌组织中表达上调，并且沉默α5-nAChR能够消除尼古丁对顺铂诱导的细胞凋亡的抑制作用。因此，α5-nAChR具有潜在的肿瘤治疗靶点作用，可能用于肿瘤的靶向治疗。WuW等通过对2298例黑色素瘤病例和6654例对照的全基因组关联研究表明CHRNA5-A3-B4基因簇多态性与黑色素瘤的发展相关。<br>
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种原位检测CHRNA5基因SNPrs16969968的方法。第一方面，本专利技术要求保护一种用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的成套原位杂交探针。本专利技术所要求保护的用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的成套原位杂交探针，由cRNA原位杂交探针1和cRNA原位杂交探针2组成；所述cRNA原位杂交探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述cRNA原位杂交探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。CHRNA5基因，cholinergicreceptornicotinicalpha5是指尼古丁乙酰胆碱受体alpha5基因，其编码产物为a5-尼古丁乙酰胆碱受体(a5-nicotinicacetylcholinereceptora5-nAChR)。该基因与肺癌等发展密切相关，是近年来肿瘤研究的热点之一。其中，所述rs16969968位点的核苷酸为G或A。所述cRNA原位杂交探针1用于检测所述rs16969968位点为G的情况(野生型)；所述cRNA原位杂交探针2用于检测所述rs16969968位点为A的情况(突变型)。进一步地，所述cRNA原位杂交探针1上带有标记分子A；所述cRNA原位杂交探针2上带有标记分子B；所述标记分子A和所述标记分子B不同。在本专利技术的具体实施方式中，所述标记分子A为地高辛；所述标记分子B为生物素。在本专利技术的具体实施方式中，所述标记分子A(地高辛)标记在所述cRNA原位杂交探针1的尿嘧啶核糖核苷酸上；所述标记分子B(生物素)标记在所述cRNA原位杂交探针2的尿嘧啶核糖核苷酸上。第二方面，本专利技术要求保护含有前文所述成套原位杂交探针的试剂盒。本专利技术所要求保护的试剂盒中还含有能够与所述标记分子A特异性结合且标记有荧光基团A的物质A，以及能够与所述标记分子B特异性结合且标记有荧光基团B的物质B；所述荧光基团A和所述荧光基团B不同。进一步地，所述荧光基团A可为Fluorescein；所述荧光基团B可为Alexa594。在本专利技术的具体实施方式中，所述物质A为标记有Fluorescein的抗地高辛抗体；所述物质B为标记有Alexa594的链霉亲和素。第三方面，本专利技术要求保护前文所述成套原位杂交探针的制备方法。本专利技术所要求保护的所述成套原位杂交探针的制备方法，可包括按照如下(A1)制备所述cRNA原位杂交探针1的步骤和按照如下(A2)制备所述cRNA原位杂交探针2的步骤；(A1)将SEQIDNo.3所示的核苷酸序列插入到pBluescriptSK(+)质粒的多克隆位点处(如HindIII/EcoRI)，得到重组质粒；将所述重组质粒以HindIII酶切进行线性化处理，得到线性化质粒；以所述线性化质粒为模板，利用T3RNA聚合酶进行体外转录，其中dUTP经所述标记分子A标记，所得标记序列即为所述cRNA原位杂交探针1；(A2)将SEQIDNo.4所示的核苷酸序列插入到pBluescriptSK(+)质粒的多克隆位点处(如HindIII/EcoRI)，得到重组质粒；将所述重组质粒以HindIII酶切进行线性化处理，得到线性化质粒；以所述线性化质粒为模板，利用T3RNA聚合酶进行体外转录，其中dUTP经所述标记分子B标记，所得标记序列即为所述cRNA原位杂交探针2。第四方面，本专利技术要求保护前文所述的成套原位杂交探针或所述的试剂盒在荧光原位杂交检测CHRNA5基因rs16969968位点中的应用。进一步地，所述应用可为非疾病诊断治疗性应用。第五方面，本专利技术要求保护一种原位检测CHRNA5基因rs16969968位点的方法。本专利技术所要求保护的原位检测CHRNA5基因rs16969968位点的方法，可包括如下步骤：(B1)用前文所述的成套原位杂交探针或所述的试剂盒对待测组织切片进行荧光原位杂交；(B2)根据杂交结果按照如下确定所述待测组织切片上CHRNA5基因rs16969968位点的SNP状态：仅仅显示所述荧光基团A所发荧光的所述待测组织切片，其对应CHRNA5基因rs16969968位点为G的纯合型；仅仅显示所述荧光基团B所发荧光的所述待测组织切片，其对应CHRNA5基因rs16969968位点为A的纯合型；同时显示所述荧光基团A所发荧光和所述荧光基团B所发荧光的所述待测组织切片，其对应CHRNA5基因rs16969968位点为G和A的杂合型。进一步地，所述方法可为非疾病诊断治疗性方法。本专利技术的有益效果是：本专利技术对病理组织或动物模型组织，通过不同荧光标记的cRNA探针与组织中CHRNA5基因的mRNA发生特异性的结合，加入荧光抗体，方便、准确的观察到组织中CHRNA5基因mRNA不同核酸的变化。本专利技术使用的CHRNA5的探针序列，对CHRNA5SNP的显示有明确的特异性，实现了对CHRNA5基因SNP状态(WT，杂合突变，纯杂突变)的显示作用。本专利技术实现了在原位检测CHRNA5基因的rs16969968位点不同基因型及突变状态的原位检测，以保留细胞位置、类型等关键细胞信息，为针对性干预CHRNA5表达提供依据。附图说明图1为荧光原位杂交检测黑素瘤组织和肺癌组织中CHRNA5基因rs16969968位点状态。A为黑素瘤组织；B为肺癌组织。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的成套原位杂交探针，由cRNA原位杂交探针1和cRNA原位杂交探针2组成；/n所述cRNA原位杂交探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；/n所述cRNA原位杂交探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测CHRNA5基因rs16969968位点的成套原位杂交探针，由cRNA原位杂交探针1和cRNA原位杂交探针2组成；
所述cRNA原位杂交探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；
所述cRNA原位杂交探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


2.根据权利要求1所述的成套原位杂交探针，其特征在于：所述cRNA原位杂交探针1上带有标记分子A；所述cRNA原位杂交探针2上带有标记分子B；所述标记分子A和所述标记分子B不同。


3.根据权利要求2所述的成套原位杂交探针，其特征在于：所述标记分子A为地高辛；所述标记分子B为生物素。


4.根据权利要求2或3所述的成套原位杂交探针，其特征在于：所述标记分子A标记在所述cRNA原位杂交探针1的尿嘧啶核糖核苷酸上；所述标记分子B标记在所述cRNA原位杂交探针2的尿嘧啶核糖核苷酸上。


5.含有权利要求1-4中任一所述的成套原位杂交探针的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有能够与所述标记分子A特异性结合且标记有荧光基团A的物质A，以及能够与所述标记分子B特异性结合且标记有荧光基团B的物质B；所述荧光基团A和所述荧光基团B不同。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光基团A为Fluorescein；所述荧光基团B为Alexa594。


7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述物质A为标记有Fluorescein的抗地高辛抗体；所述物质B为标记有Alexa594的链霉亲和素。


8.权利要求1-4中任一所述成套原位杂交探针的制备方法，包括按照如下(A1)制备所述cRNA原位杂交探针1的步骤和按照如下(A2)制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：党宁宁，黄淑红，焦敬，孟现广，宋海燕，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37