一种基于高通量测序的mRNA检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于高通量测序的mRNA检测方法，包括如下步骤：1)提取样本总RNA并质控；2)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交；3)合成cDNA第一链；4)合成cDNA第二链；5)构建链特异性cDNA文库；6)第一次杂交和捕获；7)第二次杂交和捕获；8)捕获后文库扩增及纯化；9)高通量测序。本发明专利技术采用杂交捕获的方式，特异性富集链特异性cDNA序列，进行mRNA表达检测。本发明专利技术在极低起始量和低质量情况下仍能保证良好的检测性能。

A method of mRNA detection based on high throughput sequencing

【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序的mRNA检测方法
本专利技术涉及一种基于高通量测序平台开发的mRNA检测方法。
技术介绍
已有大量研究表明，通过RNA测序的方法可以检测来自生物学样品中RNA分子标志物的相对表达频率。RNA测序也被称为全转录组鸟枪法测序，是基于NGS(Next-GenerationSequencing，第二代测序)的全转录组学研究方法。RNA测序需提取生物样品中的全部转录的RNA，然后反转录为cDNA后进行文库制备及高通量测序，在此基础上进行生物信息分析，进而可以对该生物样品的基因表达状况进行全局了解。一般提取到的总RNA中，核糖体RNA(rRNA)占比～90％，而基因表达的信息存储在信使RNA(mRNA)中。因此在进行建库测序之前，一般会先去除rRNA，富集mRNA后再进行建库流程。现有的mRNA测序技术，以基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获，以及基于rRNA去除的mRNA测序技术为主。然而，出于多种情况，受限于样品量的原因，会出现RNA提取总量不高；同时由于样本保存原因，提取到的RNA通常降解比较严重等现象。现有mRNA测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于高通量测序的mRNA检测方法，包括如下步骤：/n1)提取样本总RNA并质控：RNA总量不低于10ng，浓度不低于2ng/ul，RNA的260/280吸光值在1.8-2.0之间，RIN值不低于1，DV200不低于20％；/n2)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交：其中，DV200大于等于30％的RNA样品，需要先打断，再进行引物杂交，对于DV200小于30％的RNA样品，不需要打断，直接进行引物杂交；所述的引物为随机引物，其长度范围为5-10bp；/n3)合成第一链cDNA：在逆转录酶的作用下，以总RNA为模板，合成cDNA第一链；/n4)合成第二链cDNA：在DNA...

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序的mRNA检测方法，包括如下步骤：
1)提取样本总RNA并质控：RNA总量不低于10ng，浓度不低于2ng/ul，RNA的260/280吸光值在1.8-2.0之间，RIN值不低于1，DV200不低于20％；
2)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交：其中，DV200大于等于30％的RNA样品，需要先打断，再进行引物杂交，对于DV200小于30％的RNA样品，不需要打断，直接进行引物杂交；所述的引物为随机引物，其长度范围为5-10bp；
3)合成第一链cDNA：在逆转录酶的作用下，以总RNA为模板，合成cDNA第一链；
4)合成第二链cDNA：在DNA聚合酶的作用下，以第一链cDNA为模板，合成含有dUTP的cDNA第二链；
5)构建链特异性cDNA文库：取纯化后的cDNA产物，加入末端修复缓冲液和末端修复酶混合物进行末端修复反应；反应完成后加入接头、连接缓冲液、增强子及无核酶水进行连接反应；反应完成后加入尿嘧啶特异性切除酶切除含有U碱基的cDNA第二链；产物纯化后，加入标签引物进行文库扩增反应，经纯化后得到链特异性的cDNA文库，对文库进行定量和质控，文库总量不低于200ng；
6)第一次杂交和捕获；取固定质量的链特异性的cDNA文库，加入杂交缓冲液和全外显子探针进行第一次杂交和捕获；
7)第二次杂交和捕获；在第一次杂交和捕获的回收产物中加入杂交缓冲液和全外显子探针进行第二次杂交和捕获；
8)捕获后文库扩增及纯化；在第二次杂交和捕获的回收产物中加入扩增引物和扩增酶进行文库扩增，纯化回收产物；
9)高通量测序：对扩增后的文库定量和质控后进行高通量测序。


2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤1)中所述样本为RNA降解较为严重的样本，包括福尔马林固定石蜡包埋FFPE的样本；并且需要对RNA进行质控，得到DV200质控值。


3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤2)中，根据DV200质控值分别进行样本处理，对于DV200大于等于30％的RNA样品，取RNA样本5ul，加入4ul5×第一链合成缓冲液，1ul随机引物，总体积10ul，置于PCR仪上，按照以下程序进行打断和引物杂交反应：94℃8min，4℃保持，热盖温度105℃；对于DV200小于30％的RNA样品，取RNA样本5ul，加入1ul随机引物，总体积6ul，置于PCR仪上，按照以下程序进行引物杂交反应：65℃5min，4℃保持，热盖温度105℃。


4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤3)中，根据DV200质控值分别进行样本处理，对于DV200大于等于30％的RNA样品，取打断和引物杂交反应后的产物10ul，加入8μl链特异试剂和2μl第一链合成酶混合物，总体积20μl，置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：25℃10min，42℃30min，(60℃2min，42℃2min)进行5个循环，70℃15min，4℃保持，热盖温度不低于80℃；对于DV200小于30％的RNA样品，取引物杂交反应后的产物6ul，加入4ul5×第一链合成缓冲液，8μl链特异试剂和2μl第一链合成酶混合物，总体积20μl，置于PCR仪上，按...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕书琳，吴渊，石银，陈学俊，杨爽，王剑青，周文刚，郑方克，郑立谋，
申请(专利权)人：上海厦维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31