一种基于压电声波传感器的单分子测序方法技术

本发明专利技术公开了一种基于压电声波传感器的单分子测序方法，包括以下步骤：S1.在压电声波传感器表面修饰DNA聚合酶；S2.DNA模板单链小片段驱动进样；S3.基于质量放大原理在核苷酸磷酸链的活性端修饰磁珠；S4.修饰好的核苷酸进样；S5.在声波传感器微孔另一侧施加磁场；S6.传感器表面进行洗脱：S7.测试声波传感器的频率信号f

A single molecule sequencing method based on piezoelectric acoustic sensor

【技术实现步骤摘要】
一种基于压电声波传感器的单分子测序方法
本专利技术涉及DNA测序领域，特别涉及一种单分子测序方法。
技术介绍
基因测序(Genesequencing，或译基因定序)是指分析特定基因片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。快速的基因测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。现有基因测序方法有光学法(阵列孔)和电化学法(单个孔)，而阵列孔光学方法为了抑制信号噪声需要纳米孔，而且系统复杂而庞大导致测序成本高，有必要提出一种测序成本低廉、灵敏度高的测序方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术的主要目的是，提供一种基于压电声波传感器的单分子测序方法，其检测灵敏度高，且降低了基因测序的成本。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于压电声波传感器的单分子测序方法，包括以下步骤：S1：在压电声波传感器表面修饰DNA聚合酶；通过在压电声波传感器表面修饰DNA聚合酶以将DNA聚合酶固定在压电声波传感器表面；S2：DNA模板单链小片段驱动进样：构建单链DNA文库，驱动获得的DNA模板单链小片段进入压电声波传感器的微孔，确保一个微孔中最多只有一个DNA模板单链小片段，进入微孔的DNA模板单链在压电声波传感器表面与DNA聚合酶结合；S3：基于质量放大原理在核苷酸磷酸链的活性端修饰磁珠；在四种核苷酸磷酸链的活性端修饰磁珠，以放大四种核苷酸的质量；<br>S4：修饰好的核苷酸进样：向压电声波传感器的微孔内加入修饰磁珠的四种核苷酸；S5：在声波传感器微孔另一侧施加磁场驱动磁珠修饰核苷酸向压电声波传感器表面移动；在压电声波感器输入电极、输出电极附近施加磁场，在磁场作用下，修饰磁珠的四种核苷酸向DNA模板单链移动，具有合适碱基的核苷酸吸附在压电声波传感器表面并在DNA聚合酶的催化作用下与DNA模板单链的相应碱基互补配对；S6：传感器表面进行洗脱：撤去磁场，此时未发生特异性反应的磁珠修饰的核苷酸不再吸附在传感器表面，采用缓冲液进行表面冲刷，使非特异性反应的核苷酸脱离传感器敏感区域；S7：测试声波传感器的频率信号，标记为f1；f1是DNA模板单链和修饰磁珠的核苷酸互补配对反应后的频率值；S8：采用DNA聚合酶切除核苷酸磷酸链的活性端修饰的磁珠：合成过程中DNA聚合酶切除修饰的磁珠，把磷酸链的活性端释放出来；S9：测试声波传感器的频率信号，标记为f2；f2是当磁珠被DNA聚合酶切除后，压电声波传感器表面质量发生变化后的频率值；计算f1与f2的差值，并通过该差值确定该与DNA模板单链反应的核苷酸的碱基种类，从而确定与之对应的DNA模板单链的碱基种类；S10：清洗流道；采用清洗液清洗流道，将DNA聚合酶切除的磁珠等冲洗掉；S11：重复上述步骤S3-S10，对微孔中的DNA模板单链进行连续测序。进一步地，所述步骤S5中施加磁场的方式为通过驱动装置在传感器输入电极、输出电极附近设置磁铁，使磁铁和压电薄膜之间具有微小的间隔。优选地，所述磁铁为永磁铁。进一步地，步骤S1中采用通过聚合酶基团和传感器表面修饰的基团发生特异性反应进而结合的方式在压电声波传感器表面修饰DNA聚合酶。进一步地，步骤S1中将采用生物素、亲和素分别修饰在传感器表面与聚合酶的表面而促使二者结合的方式在压电声波传感器表面修饰DNA聚合酶。进一步地，步骤S4中通过微流控的方式将修饰磁珠的四种核苷酸引入微孔，具体通过蠕动泵或注射泵将修饰好的核苷酸引入微孔。优选地，步骤S10中采用的清洗液为PBS缓冲液。进一步地，所述压电声波传感器包括依次设置的压电薄膜层、硅片层、二氧化硅层和SOI硅片层，在二氧化硅层和SOI硅片层上设置若干微孔，在压电薄膜层的另一侧设有输入电极、输出电极和频率信号采集装置。优选地，输入电极和输出电极材料可以为金或铝；所述压电薄膜层材料可以为氮化铝、压电陶瓷或氧化锌。优选地，所述微孔为方形或圆形，微孔为方形时其边长为100um至1000um，微孔为圆形时，其直径为100um-1000um；所述微孔相互隔离且呈阵列排布。上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点或有益效果：将压电声波传感器用于单分子测序，且通过放大核苷酸质量，提高了检测灵敏度，采用声波不需要为了抑制信号噪声而采用纳米孔，避免了光学因素干扰导致的信号失真，且不需要复杂庞大的光学系统，测序成本低廉。附图说明图1为根据本专利技术一个实施方式提出的基于压电声波传感器的单分子测序原理图；图2为根据本专利技术一个实施方式提出的压电声波传感器结构示意图；图3为根据本专利技术一个实施方式提出的基因压电声波传感器进行单分子测序的流程图；图4为根据本专利技术一个实施方式提出的图1中A部分的压电声波传感器单分子测序结构示意图的放大图。图中：1、输入电极，2、输出电极，3、压电薄膜层，4、硅片层，5、二氧化硅层，6、SOI硅片层，7、频率信号采集装置，8、DNA聚合酶，9、DNA模板单链,10、引物，11、核苷酸，12、磁珠，13、微孔。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。在附图中，为清晰起见，可对形状和尺寸进行放大，并将在所有图中使用相同的附图标记来指示相同或相似的部件。根据本专利技术的一实施方式结合图1-2，本专利技术的基于压电声波传感器的单分子测序方法提供一种压电声波传感器，所述压电声波传感器包括压电薄膜层3，还包括在压电薄膜层3的一侧依次设置的硅片层4、二氧化硅层5和SOI硅片层6，通过气体刻蚀方法在硅片层4另一侧的二氧化硅层5和SOI硅片层6上形成相互隔离的呈阵列排布的若干微孔13，微孔为方形或圆形，微孔为方形时其边长为100um至1000um，微孔为圆形时，其直径为100um-1000um，微孔内放置反应液；在压电薄膜层3的另一侧设置有输入电极1、输出电极2和频率信号采集装置7，输入电极1和输出电极2的材料采用金(Au)或铝(Al)，所述压电薄膜层3可以采用氮化铝(AlN)、压电陶瓷(PZT)或氧化锌(ZnO)。当压电声波传感器表面吸附的物质质量发生变化越明显，其谐振频率发生的变化越大。即压电声波传感器频率的变化是受吸附质量变化影响的。由于单个核苷酸11质量微小，其吸附在传感器表面附近质量变化不大，测得的频率变化不明显，因此，本实施例基于质量放大原理对核苷酸11修饰磁珠12，即放大核苷酸11的质量。在外加磁场作用下具有合适碱基的修饰磁珠12的核苷酸11吸附至传感器表面并与DNA模板单链9进行反应，此时声波传感器表面等效吸附质量相对比较大，测得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于压电声波传感器的单分子测序方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1：在压电声波传感器表面修饰DNA聚合酶；/n通过在压电声波传感器表面修饰DNA聚合酶以将DNA聚合酶固定在压电声波传感器表面；/nS2：DNA模板单链小片段驱动进样：/n构建单链DNA文库，驱动获得的DNA模板单链小片段进入压电声波传感器的微孔，确保一个微孔中最多只有一个DNA模板单链小片段，进入微孔的DNA模板单链在压电声波传感器表面与DNA聚合酶结合；/nS3：基于质量放大原理在核苷酸磷酸链的活性端修饰磁珠；/n在四种核苷酸磷酸链的活性端修饰磁珠，以放大四种核苷酸的质量；/nS4：修饰好的核苷酸进样：/n向压电声波传感器的微孔内加入修饰磁珠的四种核苷酸；/nS5：在声波传感器微孔另一侧施加磁场驱动磁珠修饰核苷酸向压电声波传感器表面移动；/n在压电声波感器输入电极、输出电极附近施加磁场，在磁场作用下，修饰磁珠的四种核苷酸向DNA模板单链移动，具有合适碱基的核苷酸吸附在压电声波传感器表面并在DNA聚合酶的催化作用下与DNA模板单链的相应碱基互补配对；/nS6：传感器表面进行洗脱：/n撤去磁场，此时未发生特异性反应的磁珠修饰的核苷酸不再吸附在传感器表面，采用缓冲液进行表面冲刷，使非特异性反应的核苷酸脱离传感器敏感区域；/nS7：测试声波传感器的频率信号，标记为f...

【技术特征摘要】
1.一种基于压电声波传感器的单分子测序方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：在压电声波传感器表面修饰DNA聚合酶；
通过在压电声波传感器表面修饰DNA聚合酶以将DNA聚合酶固定在压电声波传感器表面；
S2：DNA模板单链小片段驱动进样：
构建单链DNA文库，驱动获得的DNA模板单链小片段进入压电声波传感器的微孔，确保一个微孔中最多只有一个DNA模板单链小片段，进入微孔的DNA模板单链在压电声波传感器表面与DNA聚合酶结合；
S3：基于质量放大原理在核苷酸磷酸链的活性端修饰磁珠；
在四种核苷酸磷酸链的活性端修饰磁珠，以放大四种核苷酸的质量；
S4：修饰好的核苷酸进样：
向压电声波传感器的微孔内加入修饰磁珠的四种核苷酸；
S5：在声波传感器微孔另一侧施加磁场驱动磁珠修饰核苷酸向压电声波传感器表面移动；
在压电声波感器输入电极、输出电极附近施加磁场，在磁场作用下，修饰磁珠的四种核苷酸向DNA模板单链移动，具有合适碱基的核苷酸吸附在压电声波传感器表面并在DNA聚合酶的催化作用下与DNA模板单链的相应碱基互补配对；
S6：传感器表面进行洗脱：
撤去磁场，此时未发生特异性反应的磁珠修饰的核苷酸不再吸附在传感器表面，采用缓冲液进行表面冲刷，使非特异性反应的核苷酸脱离传感器敏感区域；
S7：测试声波传感器的频率信号，标记为f1；
f1是DNA模板单链和修饰磁珠的核苷酸互补配对反应后的频率值；
S8：采用DNA聚合酶切除核苷酸磷酸链的活性端修饰的磁珠：
合成过程中DNA聚合酶切除修饰的磁珠，把磷酸链的活性端释放出来；
S9：测试声波传感器的频率信号，标记为f2；
f2是当磁珠被DNA聚合酶切除后，压电声波传感器表面质量发生变化后的频率值；
计算f1与f2的差值，并通过该差值确定该与DNA模板单链反应的核苷酸的碱基种类，从而确定与之对应的DNA模板单链的碱基种类...

【专利技术属性】
技术研发人员：周连群，李传宇，李超，郭振，姚佳，张芷齐，张威，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32