一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PD‑1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，通过本方法，可以对具有PD‑1高表达，抗肿瘤活性比较高的T细胞进行单细胞T细胞测序，从而获得该群T细胞的受体情况，通过对T细胞受体的分析和研究，可以拿到针对特定患者，特定肿瘤抗原特异性的T细胞受体，从而为后续制备嵌合抗原受体T细胞(CAR‑T)和T细胞受体改造T细胞(TCR‑T)提供遗传学基础。

A single cell sequencing method of T cell receptor based on PD-1 highly expressed T cell

【技术实现步骤摘要】
一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法
本专利技术属于生物免疫检测
，具体涉及一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法。
技术介绍
PD-1受体是表达在T细胞表面的一种免疫抑制性受体，它的高表达和激活通常会造成T细胞的大量失活与死亡。通常情况下，在长期的慢性感染以及某类肿瘤性疾病，由于T细胞持续活化参与机体的防御，从而为了调控其活性不至于发生免疫过度激活导致的自身免疫疾病。在高度活化的T细胞表面常常有PD-1受体的过度表达，与此同时，某些肿瘤组织则高度表达PD-1受体的配体PD-L1，PD-L1和PD-1的结合将会开启T细胞失活和凋亡的信号通路，从而消灭抗肿瘤T细胞，导致该类肿瘤患者肿瘤免疫极度低下。由上文可知，PD-1高表达的T细胞通常是过度激活/过度反应的T细胞，因此，其在很大程度上是具备抗肿瘤活性的T细胞。对此类T细胞的T细胞受体进行研究理论上可以获得大量针对肿瘤抗原有特异反应的T细胞受体，从而为后续的肿瘤免疫治疗提供患者/肿瘤特异性靶定机制。制备嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和T细胞受体改造T细胞(TCR-T)最关键的步骤就是获取患者/肿瘤特异性抗原靶定机制。目前，尚无对此类对PD-1高表达T细胞的T细胞受体进行检验测序方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，通过本方法，可以对具有PD-1高表达，抗肿瘤活性比较高的T细胞进行单细胞T细胞测序，从而获得该群T细胞的受体情况，通过对T细胞受体的分析和研究，可以拿到针对特定患者，特定肿瘤抗原特异性的T细胞受体，从而为后续制备嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和T细胞受体改造T细胞(TCR-T)提供遗传学基础。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，包括以下步骤：1)从待测T细胞中分选和富集PD-1高表达T细胞；2)通过微流控液滴技术制备单细胞转录组文库；3)采用二代测序技术对转录组文库进行TCR定向测序。优选地，上述方法还包括：通过物理性或酶消化分离方法从待测外周静脉血和/或肿瘤组织中得到待测T细胞。更优选地，所述待测外周静脉血和/或肿瘤组织均来自肿瘤患者。优选地，步骤1)包括：通过荧光标记PD-1抗体对待测T细胞进行标记，再通过流式细胞分选进一步分离和富集。更优选地，富集出PD-1高表达的T淋巴细胞亚群CD4+PD-1高和CD8+PD-1高细胞。优选地，上述方法还包括：分析测序拿到的T细胞受体的组织以及其抗原互补区域(CDR)的序列。更优选地，通过对CDR的生物信息学分析，以及对外周静脉血T细胞的T细胞受体和肿瘤侵润T细胞的T细胞受体进行对比，获得针对肿瘤特异性T细胞受体。本专利技术的有益效果如下：本专利技术通过对肿瘤患者体内外周血和肿瘤侵润的PD-1高表达的T淋巴细胞进行T细胞受体的单细胞定向测序分析，获取其特异性的序列，通过生物信息学分析和对比，可以获得针对患者特异性肿瘤的高活性T细胞受体的信息，从而为下一步肿瘤免疫细胞疗法提供肿瘤靶定机制。具体实施方式为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例对本专利技术做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不对本专利技术的保护范围构成限定。实施例本实施例中采用的外周静脉血及肿瘤组织均来自经临床和病理诊断确认的肝癌患者(合作医院已与患者签署知情同意书)。以下“室温”指25℃左右，22-28℃均可，“低温磷酸缓冲盐溶液/PBS”均是指4℃，pH7.4的1×PBS溶液。本专利技术大体实验设计顺序为：患者采血、取肿瘤组织——分离获取单细胞——PD-1高表达T细胞的分选与富集——微流控液滴单细胞文库的制备——二代测序针对T细胞受体的定向测序——数据库分析与对比具体实现过程如下：1、患者采血、取肿瘤组织术前或术中真空抗凝采集管采集10mL患者外周静脉血，放置于冰上或4度冰箱备用。术中收集患者肿瘤组织，保存在低温测序保存液(1×无钙镁PBS+0.04％牛血清蛋白)中于4度保存备用。2、分离获取单细胞1)针对外周静脉血①常规梯度离心法，上述全血于室温300g20分钟离心，去上清，加入生理盐水稀释至20mL。在新离心管中加入10mLFicoll溶液，再将稀释的血液缓缓倒入Ficoll溶液的上层。血液和Ficoll溶液间有明显的分层。室温500g离心20分钟，弃上清，小心吸取中间层乳白色外周血白细胞。从血液中分离白细胞，获取白细胞以后用低温磷酸缓冲盐溶液冲洗1-2次。将洗涤的白细胞用抗CD16/CD32抗体室温封闭30分钟。②使用荧光染料标记的FITC染料标记-抗PD-1，APC染料标记-抗CD3，APC/Cy7标记-抗CD8以及PE/Cy5标记-抗CD4抗体。将避光保存的荧光染料标记的抗体直接加到白细胞悬液中。室温，避光孵育血中分离的白细胞30分钟。2)针对肿瘤组织①将收集的肿瘤组织从保存液中取出，用无菌手术刀切成0.5cm×0.5cm的小块，并用0.25％胰酶在37度水浴消化成单细胞。用低温PBS洗涤1-2次，将洗涤的白细胞用抗CD16/CD32抗体室温封闭30分钟。②然后使用不同荧光染料标记的抗PD-1，抗CD3，抗CD8和抗CD4抗体室温孵育30分钟。3、将荧光染料标记好的细胞用低温PBS洗涤1-2次去除多余抗体，通过BDAria系列流式细胞分选仪分选，富集出PD-1高表达的T淋巴细胞亚群(CD4+PD-1高和CD8+PD-1高细胞)。通常情况下，在CD4和CD8细胞亚群中，其PD-1的表达是有高有低，通过荧光抗体的标记，可以将PD-1表达的程度通过荧光强度的形式表现出来，我们通过流式分选技术，就可以将高表达与低表达的区分，并收集特异的高表达亚群。4、对收集的PD-1高表达的T淋巴细胞亚群分别进行基于微流控液滴技术的单细胞转录组进行单独标记，并建立文库，从而完成单细胞测序的第一步。具体步骤为：流式分选富集的单细胞与带有DNA条形码的水凝胶珠，cDNA合成酶，以及设计在TCRC区域的巢式PCR引物等成分，通过微量注射技术，在微通道，通过油相与水相的分离，包裹在液滴中。从而完成单细胞测序的第一步。再下一步就是通过各级PCR反应，将测序引物引物连接到已标记的转录组mRNA上。以上仅为简述，本领域技术人员可采用常规技术手段实现，在此不做限定。5、通过使用Illumina二代测序仪对获得的转录组文库进行T细胞受体的深度测序。6、得到TCR定向测序的结果以后，通过生物信息学方法，通过自主设计的分析数据包，对T细胞受体的表达情况在TCR特异性序列的数据库https://vdjdb.cdr3.net/进行初步分析和对比。在进行纵向研究的同时，尤其重要的是用外周血T细胞受体的信息跟肿瘤侵润T细胞受体进行横向对比，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，包括以下步骤：/n1)从待测T细胞中分选和富集PD-1高表达T细胞；/n2)通过微流控液滴技术制备单细胞转录组文库；/n3)采用二代测序技术对转录组文库进行TCR定向测序。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，包括以下步骤：
1)从待测T细胞中分选和富集PD-1高表达T细胞；
2)通过微流控液滴技术制备单细胞转录组文库；
3)采用二代测序技术对转录组文库进行TCR定向测序。


2.根据权利要求1所述的一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，其特征在于，还包括：通过物理性或酶消化分离方法从待测外周静脉血和/或肿瘤组织中得到待测T细胞。


3.根据权利要求2所述的一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，其特征在于，所述待测外周静脉血和/或肿瘤组织均来自肿瘤患者。


4.根据权利要求1所述的一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，其特征在于，步骤1...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷峰阳，
申请(专利权)人：苏州安泰赫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32