带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。本发明专利技术将铁蛋白与EW29标签、TEV蛋白酶切位点相连，得到EW29标签/TEV蛋白酶识别位点/铁蛋白重组序列，诱导、亲和纯化后即得融合蛋白。电镜结果显示，该融合蛋白形成了20～25 nm的蛋白笼纳米颗粒。本发明专利技术构建的EW29/铁蛋白载体，可以作为一种新型的促溶、纯化、包封平台，可将不同的目的蛋白串联到铁蛋白中，从而提高目的蛋白的可溶性和敏感性。

Ferritin fusion protein and protein cage nanoparticles labeled with galactose binding lectin ew29 and their preparation

【技术实现步骤摘要】
带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。
技术介绍
通过DNA重组技术，融合蛋白已经很容易在原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（酵母和哺乳动物细胞）进行高效表达，其产物在生物和医学上得到了广泛应用，也促进了其快速发展。与真核表达系统相比，大肠杆菌由于易操作、廉价和产量高等优点，仍然是目前生产重组蛋白的主要宿主。但是，当大肠杆菌细菌系统表达重组蛋白时，有许多本身难以克服的缺点：1、重组蛋白往往以无活性的包涵体形式出现；2、缺乏真核细胞翻译后修饰（糖基化、磷酸化和乙酰化等）机制，得到的重组蛋白虽然在一级氨基酸序列正确，但在高级结构和构象上与天然蛋白相差较大，无活性或活性极差；3、宿主细胞（大肠杆菌）自身蛋白成为热原，难以除去，存在安全性，这些问题限制了原核表达的重组蛋白在实际中的进一步应用。鉴于此，选择更有效的亲和促溶性标签以期获得纯度高、可溶性好，活性强的重组蛋白至关重要。来自蚯蚓（Lumbricusterrestris）半乳糖结合凝集素EW29C-末端的半乳糖结合结构域，其分子量为14.5kDa，可以和亲和层析的常用介质琼脂糖的半乳糖残基可逆结合，是一个高效的亲和标签。同时，EW29蛋白本身有很好的可溶性，和其它外源蛋白融合表达时，可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性（YabeR,SuzukiR,KunoA,FujimotoZ,JigamiYandHirabayashiJ(2007)Tailoringanovelsialicacidbindinglectinfromaricin-Bchain-likegalactosebindingproteinbynaturalevolution-mimicry.JBiochem141,389–399.）。原核表达系统因其操作简单，价格低廉，在基因工程、蛋白工程等领域的研发和应用越来越受到重视。对于亲和标签，常选择6×His，但是常规His亲和标签纯化过程中引入咪唑分子，含有毒性作用，蛋白脱盐后仍可能有咪唑残留影响，对动物机体造成损伤；通常为了增加目的蛋白的可溶性，还需要另外串联促溶标签。铁蛋白(Ferritin)几乎存在于藻类、细菌、高等植物和动物等所有生物体，是生物体生命所必需的。蛋白壳是由24个亚基以高度对称性方式组成的内空心结构，空心直径约为8nm，外直径约为12nm。研究发现铁蛋白在体外可以自组装，形成套袖样的蛋白笼纳米颗粒；同时，铁蛋白纳米笼可以将外源小分子蛋白装入其纳米笼内，从而有效降低小分子抗原的降解，提高抗原的有效浓度，还可以有效协助靶细胞对相应抗原的摄取、加工，显著增强抗原蛋白的抗原稳定性和免疫原性。因此，铁蛋白独特的结构及理化性质使其可以作为一种新型的抗原递呈纳米运送平台。
技术实现思路
本专利技术利用半乳糖结合凝集素EW29作为亲和促溶标签，高效可溶性表达和纯化带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，该融合蛋白经过自组装可形成蛋白笼纳米颗粒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术第一方面提供带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，包括EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段，所述TEV蛋白酶识别位点位于EW29标签的C端，所述铁蛋白片段位于TEV蛋白酶识别位点的C端，EW29标签的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；该带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封的蛋白笼纳米颗粒。优选的，所述TEV蛋白酶识别位点的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。优选的，表达所述EW29标签的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。优选的，表达所述TEV蛋白酶识别位点的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，表达所述铁蛋白片段的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术第二方面提供带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒。本专利技术第三方面提供上述融合蛋白笼纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：步骤1：将EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段的核苷酸序列串联，形成EW29标签/TEV蛋白酶识别位点/铁蛋白重组序列；步骤2：将重组序列连接至pET21b中，构建重组载体；步骤3：将重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，经过诱导表达和亲和层析纯化，得到目的蛋白带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白；纯化的目的蛋白进行自组装形成蛋白笼纳米颗粒。本专利技术第四方面提供一种重组载体，所述的重组载体包含有如上述任一项所述的核苷酸序列。本专利技术第五方面提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有上述的重组载体。本专利技术第六方面，提供上述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、上述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒、上述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法在制备疫苗、抗原、蛋白分子等生物工程领域中的应用。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术将EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段连接，得到了完全可溶性表达的铁蛋白；同时，琼脂糖可逆结合的EW29蛋白的引入，为后期蛋白纯化提供便利，具体表现在EW29蛋白可以和琼脂糖可逆结合，为亲和层析纯化目的蛋白奠定了基础，规避了常规His亲和标签纯化过程中咪唑溶液含有毒性作用的影响。本专利技术在含有5mM乳糖的缓冲液条件下通过洗脱得到了目的蛋白。铁蛋白在表达时可以自组装成颗粒均一、20nm左右的铁蛋白纳米笼颗粒。2、本专利技术表达的可溶性的EW29/AfFtn纳米颗粒，为半乳糖结合凝集素EW29作为亲和促溶标签和铁蛋白包裹其他目的蛋白的研发奠定基础。附图说明图1为本专利技术重组载体构建示意图。图2为本专利技术重组蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达SDS-PAGE分析图。M.Marker；1、8、18.诱导前全菌；2.pH6.0破碎后总蛋白；3.pH6.0破碎后上清；4.pH6.0破碎后沉淀；5.pH7.0破碎后总蛋白；6.pH7.0破碎后上清；7.pH7.0破碎后沉淀；9.pH8.0破碎后总蛋白；10.pH8.0破碎后上清；11.pH8.0破碎后沉淀；12.pH9.0破碎后总蛋白；13.pH9.0破碎后上清；14.pH9.0破碎后沉淀；15.pH10.0破碎后总蛋白；16.pH10.0破碎后上清；17.pH10.0破碎后沉淀；19.pH11.0破碎后总蛋白；20.pH11.0破碎后上清；21.pH11.0破碎后沉淀；22.pH12.0破碎后总蛋白；23.pH12.0破碎后上清；24.pH12.0破碎后沉淀；25.pH13.0破碎后总蛋白；26.pH13.0破碎后上清；27.pH13.0破碎后沉淀。图3为本专利技术重组蛋白纯化SDS-PAGE分析图。A.M.Mark本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，包括EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段，所述TEV蛋白酶识别位点位于EW29标签的C端，所述铁蛋白片段位于TEV蛋白酶识别位点的C端，EW29标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；该带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封的蛋白笼纳米颗粒。/n

【技术特征摘要】
1.带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，包括EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段，所述TEV蛋白酶识别位点位于EW29标签的C端，所述铁蛋白片段位于TEV蛋白酶识别位点的C端，EW29标签的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；该带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封的蛋白笼纳米颗粒。


2.根据权利要求1所述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，所述TEV蛋白酶识别位点的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


3.根据权利要求1所述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，表达所述EW29标签的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求2所述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，表达所述TEV蛋白酶识别位点的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，表达所述铁蛋白片段的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。


5.权利要求1～4任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玉堃，常雯茹，王梦珂，张爽，郭豫杰，杨国宇，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41