重组的人源化GPC3抗体及其构建和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种重组的人源化GPC3抗体及其构建和应用。本发明专利技术重组的人源化GPC3抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的碱基序列为SEQUENCE NO:VH，轻链可变区碱基序列为SEQUENCE NO:VL，抗体结合人IgG1 Fc。本发明专利技术将目的基因GPC3抗体的轻链可变区碱基序列和重链可变区碱基序列嵌合到CHO‑K1稳定细胞系的染色体中，构件稳定的细胞系，并能够长期稳定存在，在传代过程中不会丢失，能够稳定的表达GPC3抗体。

Construction and application of recombinant human GPC3 antibody

【技术实现步骤摘要】
重组的人源化GPC3抗体及其构建和应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种重组的人源化GPC3抗体及其构建和应用。
技术介绍
抗体人源化，是重组抗体(单克隆抗体)生产制备实验研究的重要组成部分，到1975年单克隆抗体技术的问世，抗体与抗原特异性结合的应用和抗体人源化的研究得到了广泛的重视和应用。初期在临床上使用的单抗多数为鼠源性单抗，由于人和小鼠的种属特异性，鼠源性抗体的使用存在种种限制。鼠抗虽然对靶抗原是特异的，可以与靶抗原特异性结合，但它不能激活相应的人体效应系统，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)等，从而无法正常的发生抗原-抗体反应。此外，鼠抗体作为外源性蛋白进入人体，会使人体免疫系统产生应答，产生以鼠抗体作为抗原的特异性抗体，即产生人抗鼠抗体(HAMA效应)。由于鼠源性抗体在临床应用上存在种种限制，人们利用重组基因技术对鼠源抗体进行人源化改造，这就是人源化抗体技术，具体的来说就是指此抗体为通过基因工程技术，将人IgG的恒定区C区与鼠IgG可变区V区连接，导入细胞内表达制备而成的抗体。相较于传统方法制备的多克隆抗体在应用中易受到生产批次的影响，单克隆抗细胞株存在抗体染色体丢失、细胞复苏后停止生长或死亡等风险，而重组抗体具有序列已知，抗体基因可以长期保存，抗体性质稳定，实验重复性好等优点，是一种标准化的抗体生产流程，回避了单多抗生产保存过程中出现的风险因素。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC-3)，调控着细胞生长、繁殖、分化、黏附和迁移等行为，在肝癌组织中的特异性表达率较高，可高达96％以上，因此，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体(GPC-3抗体)有着极其重要的作用。而以上所描述的重组抗体的表达，必须通过稳定高效的表达载体实现，杂交瘤细胞有丢失高特异性高活性的风险，或者细胞状态不好乃至死亡，直接用作重组表达载体效果较差。本专利技术旨在构建一种可以用于重组抗体稳定高效表达的载体细胞系，为后续开发人源化重组抗体奠定基础。
技术实现思路
本专利技术提供一种表达稳定高效的重组的人源化GPC3抗体的构建和应用。解决的技术问题是：传统载体细胞系用于抗体人源化，重组表达稳定性差，效率低，丢失高特异性和高活性的风险较大。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术重组的人源化GPC3抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：重链可变区的碱基序列为SEQUENCENO:VH，轻链可变区碱基序列为SEQUENCENO:VL，抗体结合人IgG1Fc。本专利技术一种稳定分泌GPC3抗体的细胞株GPC3-FX，含有权利要求1所述的重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列。本专利技术细胞株GPC3-FX的培育方法，包括以下步骤：1.1、制备GPC-3抗原工作液；纯化GPC-3抗原蛋白，透析后浓缩；1.2、动物免疫；将步骤1.1制得的GPC-3抗原工作液与弗氏佐剂等体积混合乳化，免疫小鼠，末次免疫一周后采血，检测抗体效价，采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，准备进行细胞融合；1.3、细胞融合前复苏培养骨髓瘤SP2/0细胞株，准备骨髓瘤SP2/0细胞；1.4、制备小鼠脾细胞悬液；1.5、细胞融合：将小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，选择阳性孔细胞进行亚克隆，直至获得可稳定分泌GPC-3抗体的细胞株GPC3-FX。本专利技术一种人源化重组质粒，包含权利要求1所述的重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列。本专利技术人源化重组质粒的构建，其特征在于：包括以下步骤：(1)、重组抗体基因的获得；所述重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列与人源抗体的Fc基因序列进行拼接，制备重组的人源化GPC3抗体重链序列VH-hFc-GPC3；合成基因片段的两端设计NheI与EcoRI酶切位点，以pUC57为载体，获得携带有重组基因的质粒分别为pUC57-VL-GPC3和pUC57-VH-hFc-GPC3；(2)制备人源化重组质粒；将重组的pUC57-VL-GPC3质粒和pUC57-VH-hFc-GPC3质粒与载体pCDNA3.1/ZEO(+)分别使用NheI与EcoRI双酶切，回收VL-GPC3片段、VH-hFc-GPC3片段与pCDNA3.1/ZEO(+)载体片段，并使用T4Ligase进行连接，分别得到重组质粒pCDNA3.1/ZEO(+)-VL-GPC3与pCDNA3.1/ZEO(+)-VH-hFc-GPC3。本专利技术人源化重组质粒的构建，其特征在于：步骤(1)中所述人源抗体的Fc基因序列为人IgG1Fc基因序列。本专利技术一种人源化重组质粒的应用，用于构建稳定表达权利要求1所述重组的人源化GPC3抗体的细胞株，其特征在于：包括以下步骤：A、转染及筛选阳性克隆；将权利要求4所述重组质粒pCDNA3.1/ZEO(+)-VL-GPC3与pCDNA3.1/ZEO(+)-VH-hFc-GPC3，用阳离子质脂体共转染中华仓鼠卵巢细胞CHO-K1，然后筛选整合GPC-3抗体的稳定转染细胞株；B、氨甲基喋呤MTX的加压培养；将步骤A形成的所有阳性克隆细胞用胰酶消化后接种到细胞培养皿中混合培养，获得能够在10-6mol/L的氨甲基喋呤MTX正常生长的重组CHO-K1细胞的混合克隆株，命名为CHO/hFc-GPC3。本专利技术细胞株的应用，其特征在于：用于制备重组的人源化GPC3抗体，所述人源化GPC3抗体为权利要求1所述抗体。本专利技术人源化GPC3抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：C、单克隆的扩大培养及蛋白收获；选择表达水平最高的细胞株CHO/hFc-GPC3于CDCHO培养基培养，待细胞张满时，换用无血清培养基，1-2天后收集细胞培养液，可连续进行收液3-5次；D、表达蛋白的纯化及初步测定；采用ProteinASepharose4FastFlo分离介质进行亲和层析，纯化表达蛋白；E、重组的人源化GPC-3抗体表达量的检测。本专利技术权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤A中以pEGFP-C1质粒作为指示质粒，以5％的比例与要转染的目的质粒进行混合，在转染过程中作为转染成功与否的指示。本专利技术制备重组的人源化GPC3抗体及其构建和应用与现有技术相比，具有如下有益效果：本专利技术重组的人源化GPC3抗体，将人源的IgG1的Fc片段替代了鼠源的Fc片段，大大降低了引起抗体HAMA效应的几率，从而降低了在临床IVD诊断方法中为了消除HAMA效应的阻断剂的使用量。常规方法制备的单克隆抗体，是在杂交瘤中表达的，使用的杂交瘤大多是由小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合而得到的，不稳定，在后续的传代过程中很容易丢失染色体，导致抗体的表达量以及表达序列出现变异。本专利技术将目的基因GPC3抗体的轻链可变区碱基序列和重链可变区碱基序列嵌合到CH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组的人源化GPC3抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：重链可变区的碱基序列为SEQUENCE NO:VH，轻链可变区碱基序列为SEQUENCE NO:VL，抗体结合人IgG1Fc。/n

【技术特征摘要】
1.重组的人源化GPC3抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：重链可变区的碱基序列为SEQUENCENO:VH，轻链可变区碱基序列为SEQUENCENO:VL，抗体结合人IgG1Fc。


2.一种稳定分泌GPC3抗体的细胞株GPC3-FX，其特征在于：含有权利要求1所述的重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列。


3.权利要求2所述的细胞株GPC3-FX的培育方法，其特征在于：包括以下步骤：
1.1、制备GPC-3抗原工作液；纯化GPC-3抗原蛋白，透析后浓缩；
1.2、动物免疫；将步骤1.1制得的GPC-3抗原工作液与弗氏佐剂等体积混合乳化，免疫小鼠，末次免疫一周后采血，检测抗体效价，采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，准备进行细胞融合；
1.3、细胞融合前复苏培养骨髓瘤SP2/0细胞株，准备骨髓瘤SP2/0细胞；
1.4、制备小鼠脾细胞悬液；
1.5、细胞融合：将小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，选择阳性孔细胞进行亚克隆，直至获得可稳定分泌GPC-3抗体的细胞株GPC3-FX。


4.一种人源化重组质粒，其特征在于：包含权利要求1所述的重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列。


5.权利要求4所述的人源化重组质粒的构建，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、重组抗体基因的获得；
所述重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列与人源抗体的Fc基因序列进行拼接，制备重组的人源化GPC3抗体重链序列VH-hFc-GPC3；
合成基因片段的两端设计NheI与EcoRI酶切位点，以pUC57为载体，获得携带有重组基因的质粒分别为pUC57-VL-GPC3和pUC57-VH-hFc-GPC3；
(2)制备人源化重组质粒；
将重组的pUC57-VL-GPC3质粒和pUC57-VH-hFc-GPC3质粒与载体pCDNA3.1/ZEO(+)分别使用NheI与EcoRI双酶切，回收VL-GPC3片段、VH-hFc-GPC3片段与pCDNA3.1/ZEO(+)载体片段，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，赵树杰，
申请(专利权)人：南京拂晓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32