一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用；制备方法为：根据pET25b(+)‑HSP16.5表达载体的基因序列，合成促凋亡肽KLAK肽对应的单链DNA序列，退火处理后产物与载体进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切，凝胶回收酶切产物，将KLAK序列与载体连接，连接产物转化至DH5a大肠杆菌感受态中，挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒测序；将测序正确的pET25b(+)‑HSP‑KLAK质粒转化至BL21大肠杆菌感受态中，扩大培养，超声破碎菌体得到相应粗产物，然后纯化，透析浓缩冻干后得到HSP‑KLAK蛋白；本发明专利技术的携带抗肿瘤肽的热休克蛋白纳米颗粒可以被肿瘤细胞快速摄取，在溶酶体中释放后，靶向线粒体发挥肿瘤杀伤功能，而药物载体本身蛋白质可被细胞快速降解，达到良好的肿瘤治疗效果。

A kind of protein nanoparticles carrying antitumor peptide and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用。
技术介绍
癌症，又称恶性肿瘤，是由于多因素引发、多基因突变、多阶段发展的多发病，传统化疗药物在临床使用过程中产生的严重毒副作用和肿瘤细胞的多重耐药性等问题严重限制了它们在肿瘤治疗中的应用。多肽是由少量氨基酸(10～100个)组成的小“蛋白”，具有分子量小、易改造修饰、结构清楚、作用机制明确、活性接近蛋白等优点，集化学药和蛋白药优势于一身，因此成为当前抗癌药研发的热点领域之一。抗肿瘤肽(KLAKLAK)2(KLAK)是一种合成的抗菌肽，只对肿瘤细胞有杀伤作用，研究发现其可在表面形成具有阳离子氨基酸的α-螺旋，破坏真核线粒体膜和原核膜的完整性，使细胞程序性死亡。但由于亲水性，使其不能有效内化到肿瘤细胞中，所以它必须与细胞穿透部分的受体或配体偶联，通过受体非依赖性和依赖性机制进入靶细胞，才能发挥促凋亡特性。因此，对游离肽进行改造和修饰，开发一种有效进入肿瘤细胞、增强药物对肿瘤细胞的杀伤特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒，其特征在于，具体为HSP-KLAK纳米颗粒，其氨基酸序列如下：GPLGLAGKLAKLAKKLAKLAK。/n

【技术特征摘要】
1.一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒，其特征在于，具体为HSP-KLAK纳米颗粒，其氨基酸序列如下：GPLGLAGKLAKLAKKLAKLAK。


2.根据权利要求1所述携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述HSP-KLAK纳米颗粒的粒径为35-45nm。


3.根据权利要求1所述携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)pET25b-HSP16.5-KLAK表达载体的构建：
A：合成KLAK的DNA片段：
上游引物：
5’CCCAAGCTTGGACCATTAGGATTAGCAGGAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAGCGGCCGCACTCGAGCGG3’；
下游引物：
5’CCGCTCGAGTGCGGCCGCTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTCCTGCTAATCCTAATGGTCCAAGCTTGGG3’；
根据上述序列，合成单链DNA片段，通过PCR反应扩增得到KLAK的DNA片段；
B：将KLAK的DNA片段和载体pET25b-HSP16.5分别进行双酶切，然后核酸电泳，凝胶回收得到酶切产物，将酶切后的KLAK的DNA片段和酶切后的载体pET25b-HSP16.5进行连接，构建重组质粒；
C：将所述重组质粒转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞中，进行氨苄抗性筛选，然后测序，测序正确的重组质粒为pET25b(+)-HSP-KLAK质粒；
(2)pET25b(+)-HSP-KLAK质粒表达菌株的构建：
将pET25b(+)-HSP-KLAK质粒转化至BL21大肠杆菌的感受态细胞中，并将转化后的菌株保存于甘油；
(3)pET25b(+)-HSP-KLAK质粒在BL21大肠杆菌中的诱导表达及纯化：
A：诱导表达：将步骤(2)制得的菌株接种于LB中培养，通过IPTG诱导表达，诱导4h-6h，然后离心分离，得上清液和沉淀，...

【专利技术属性】
技术研发人员：关新刚，夏薇，王冬梅，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22